摘要: 选题依据：酸枣叶为鼠李科枣属植物酸枣ZiziphusjujubaMill.Var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥叶(LZJS)，资源丰富，缺乏有效的利用途径而被浪费。酸枣叶又名棘叶，始载于《本草纲目》，具有“敛疮解毒，治胫臁疮”之功效。酸枣叶中含有丰富的黄酮、... 展开 选题依据：酸枣叶为鼠李科枣属植物酸枣ZiziphusjujubaMill.Var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥叶(LZJS)，资源丰富，缺乏有效的利用途径而被浪费。酸枣叶又名棘叶，始载于《本草纲目》，具有“敛疮解毒，治胫臁疮”之功效。酸枣叶中含有丰富的黄酮、皂苷、氨基酸、核苷类和微量元素等营养成分。现代药理研究表明，酸枣叶具有明显的镇静安神、抗氧化和保护肝脏等多种保健功效。改善睡眠、抗氧化作用的研究是酸枣叶研究领域热点之一。课题组前期研究发现酸枣叶中总黄酮含量可高达8.04%，并且对提取纯化工艺进行优化，得到了酸枣叶总黄酮部位(纯度41%，得率10%)。对总黄酮部位进行表征发现酸枣叶中黄酮类成分多以黄酮醇类(槲皮素、山奈酚)为苷元，具有很高的抗氧化活性。以槲皮素和山奈酚为苷元的化合物不以原型入血，经肠道菌转化为活性物质，被人体吸收利用。 因此本研究提出“酸枣叶总黄酮(LZJSF)是否在人体肠道菌群的代谢转化作用下产生了抗氧化活性产物，其在体内是否具有抗氧化作用，作用机制是什么？”的研究假说。对以上问题的回答将有助于对LZJSF的充分开发利用。 目的：建立快速、准确、高效的LZJSF质量控制方法；比较LZJSF经正常人肠道菌液转化前后的化学成分及抗氧化活性的变化，以期阐明LZJSF的抗氧化活性产物；以D-gal诱导的氧化损伤大鼠为研究对象，从经典药效学，代谢组学及肠道菌群的角度阐明LZJSF改善D-gal诱导的氧化损伤大鼠的多途径、多靶点作用机制。 方法： 1.建立基于多反应监测扫描-数据依赖性获取-增强子离子扫描(Multiple reaction monitoring-Information dependent acquisition-Enhanced product ion scanning ， MRM-IDA-EPI)模式对LZJSF中6种成分定性和定量分析方法并且对其进行方法学考察；采用已建立的方法测定3批样品中6个成分的含量。 2.采用体外离体粪便温孵法对LZJSF进行转化，利用LC-Q-Orbitrap-MS/MS技术对肠道菌转化前后样品中原型成分及代谢产物进行定性和定量分析；并从化学水平采用DPPH·、O2-和Fe3+还原方法及细胞水平采用过氧化氢诱导PC12细胞对转化前后的抗氧化活性进行评价。 3.体内腹腔注射D-gal建立氧化损伤大鼠模型，以Morris水迷宫实验评价LZJSF对D-gal诱导的氧化损伤大鼠学习记忆能力的改善作用，并考察了LZJSF对D-gal诱导的氧化损伤大鼠血清及脑组织中丙二醛(MDA，Malondialdehyde)等抗氧化指标的影响。应用1H-NMR代谢组学技术结合多元统计方法对D-gal诱导的氧化损伤大鼠血清中内源性代谢产物的变化规律及代谢途径进行分析，并考察LZJSF对内源性小分子及代谢途径的调节作用。最后，从肠道菌群的角度考察LZJSF对D-gal诱导的氧化损伤大鼠肠道菌群的影响。 结果：1.建立了一种基于MRM-IDA-EPI模式的LC-MS/MS同时测定LZJSF中6种成分含量的方法，在检测灵敏度高、定量准确的MRM基础上，进一步联合EPI扫描在较低浓度条件下生成二级子离子全扫描图，同时定性定量分析，防止出现假阳性峰干扰判断。其中quercetin-3-O-Rob、quercetin-3-O-Rut、quercetin-3-O-β-D-Gal、quercetin-3-O-β-D-Glu、quercetin-3-Rha、quercetin的平均含量分别为10.4%，8.3%，0.1%，0.3%，0.2%，0.005%。 2.成功建立了离体粪便温孵体系，并建立了UPLC-Q-Orbitrap/MS分析LZJSF经肠道菌群转化前后化学成分的分析方法；以槲皮素和山奈酚为母核的苷类化合物经过肠道菌水解为苷元，苷元随后水解为小酚酸类化合物。在转化0h、1h、2h的样品中quercetin-3-O-Rut、quercetin-3-O-Rob、quercetin-3-O-β-D-Glu、quercetin-3-O-β-D-Gal、quercetin-3-Rha、kaempferol-3-O-Rut含量高；转化4h、6h样品中苷元类化合物quercetin、taxifolin、kaempferol含量高；转化24和48h样品中主要含有小酚酸类化合物3,4-dihydroxyphenylaceticacid、3-hydroxyphenylaceticacid、4-hydroxyphenylaceticacid、m-hydroxyphenylpropionicacid、3-phenylpropionicacid、4-hydroxybenzoicacid、p-hydroxyphenylpropanoicacid。对转化前后样品的化学活性测定发现其对DPPH·、O2-的清除能力4h、6h>0h、1h、2h>24h、48h，对Fe3+的还原能力4h、6h>0h、1h、2h>24h、48h。在H2O2诱导PC12细胞损伤也发现相同的趋势，MDA、ROS的含量24h>0h>4h、6h。 3.LZJSF干预D-gal致氧化损伤大鼠的代谢组学与肠道菌群研究(1)LZJSF对D-gal大鼠的干预作用，与Control大鼠比D-gal组大鼠在原平台象限活动路程、活动时间、穿越原平台的次数及游泳速度均小于Control，说明模型成功。比较LZJSF的行为学、血清及脑生化指标，结果表明LZJSF(200 mg/kg)能高效地清除体内多余的自由基，修复生物体的氧化应激损伤，使氧化损伤大鼠的学习记忆力提高。(2)LZJSF对D-gal大鼠的血清代谢组学研究，通过OPLS-DA模型的VIP>1值并结合t-test的发现D-gal组大鼠12个代谢物发生显著变化，给药后组使valine、isoleucine、leucine和aceticacid等11个代谢物回调。MetPA结果显示LZJSF(200 mg/kg)主要通过调节牛磺酸和次牛磺酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和丙酮酸代谢途径发挥作用。(3)LZJSF对D-gal大鼠的肠道菌群影响。Alpha多样性分析发现，LZJSF(100 mg/kg)和LZJSF(200 mg/kg)组使菌群Alpha多样性恢复，LZJSF(200 mg/kg)组可以通过影响门(Firmicutes、Bacteroidetes、Firmicutes/Bacteroidetes )、科(Lactobacillaceae、Coriobacteriaceae、Bacteroidales-S24-7)、属(Unclassified S24-7、Lctobacillus)水平的菌群丰度而对氧化损伤大鼠的肠道菌群起到调节作用。(4)菌群与差异化合物进行皮尔逊相关性分析发现与氧化损伤相关的差异代谢物与肠道菌群的调节具有正相关性或负相关性。 结论：本文建立了一种基于MRM-IDA-EPI模式6种化学成分含量测定方法，方法重复性好、准确度高，可用于LZJSF中6种化学成分的含量测定及质量控制；鉴别了LZJSF肠道菌转化后样品中18种原型成分及7种代谢产物，阐明了LZJSF中以槲皮素和山柰酚为母核的糖苷类化合物的转化规律；4h和6h为总黄酮代谢转化的关键时间点，糖苷类化合物含量显著降低，而苷元明显升高；且其在化学水平及细胞水平抗氧化活性均最强。LZJSF(200 mg/kg)可改善D-gal诱导的氧化损伤大鼠的记忆损伤及氧化应激作用；LZJSF(200 mg/kg)主要通过调节(1)牛磺酸和次牛磺酸代谢(2)甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(3)丙酮酸代谢发挥抗氧化损伤作用；LZJSF(200 mg/kg)可通过影响门、科、属水平的菌群丰度而对氧化损伤大鼠的肠道菌群起到调节作用。与氧化损伤相关的差异代谢物与肠道菌群的调节具有正相关性或负相关性。 收起