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[学位论文] 骆璐中国中医科学院 2021年博士导师: 陈士林共431页

摘要 : 目的：药用植物外源性有害残留物污染现象严重影响药材的安全性及有效性。针对规模化种植药用植物的污染状况，本研究旨在建立药用植物外源性有害残留物系统的检测方法体系、风险评估体系、有害残留物标准及质量管控体系，提出保障药材质量及安... 展开目的：药用植物外源性有害残留物污染现象严重影响药材的安全性及有效性。针对规模化种植药用植物的污染状况，本研究旨在建立药用植物外源性有害残留物系统的检测方法体系、风险评估体系、有害残留物标准及质量管控体系，提出保障药材质量及安全性的有效措施。方法： 1.药用植物农残的检测收集了1771批次共182种大规模种植的药用植物样本，通过文献检索确定了药用植物中常检出的、禁用的、以及高毒的共136个农药残留，使用液相色谱-串联质谱(LC/MS-MS)或气相色谱-串联质谱(GC/MS-MS)对136种具有高毒和高检出率的农药进行检测，建立了药用植物的多残留农药检测体系。通过欧盟药典公式，计算出农药的最大残留限量，计算其检出率及超标率。 2.药用植物重金属的检测采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对1773批次共86种药用植物中五种重金属镉(Cd)、铅(Pb)、砷(As)、汞(Hg)和铜(Cu)进行检测。根据20个国家和地区以及7个国际组织颁布的五种重金属的现有标准，分别计算重金属的检出率及超标率。 3.药用植物农残的风险评估对于农残造成的健康风险，采用膳食风险评估区分由于农残暴露量升高而对健康构成的可接受或不可接受风险。应用危害商(HQ)和危害指数(HI)来量化急性、慢性以及药用植物农残的累积暴露风险;采用风险安全序数，通过风险等级评分对农药和药材的风险等级进行分类和排序。通过将农药毒性、农药摄入量和可检测残留水平的相应分值进行计算，得到农药的风险等级得分(S)和药材的风险指数(RI)。此外，首次建立了针对药用植物农残的健康影响评估体系，将致癌和非致癌风险与疾病发病率相关联。对药用植物农药残留引起的患者摄入量以及相关癌症和非癌症聚集效应进行量化，并将两者合并成患者健康影响得分(IS)，用伤残调整生命年(DALY)表示。 4.药用植物重金属的风险评估对于重金属造成的健康风险，采用膳食风险评估、非癌症风险评估和癌症风险评估探讨药用植物中重金属污染对人体健康的潜在影响。膳食风险评估计算出每日预估重金属摄入量(EDI)与各金属的每日可接受摄入量(PTDI)比较;非癌症风险分别计算了每种药材中各金属的非癌症危害商(HQ)及每种药材的总非致癌危害指数(HI);同时计算了每种药材中三种明确癌症风险金属的癌症风险值(CR)，与癌症强度因子(CSF)比较，并计算了每种药材的总癌症风险值。结果： 1.药用植物农残检出及超标情况农残的总检出率为88.03％（1559批次），超标率为59.01％（1045批次）。根据欧盟(EU)、美国(US)和中国的相关规定，共检出35种禁用农药。在至少42.97％的样品（761批次）中检测到35种禁用农药，其中速灭磷和总DDT分别的检出率分别为24.20％(LC/MS-MS，242/1000)和13.10％(GC/MS-MS，101/771)。此外，8种禁用农药的浓度水平比欧盟标准高出500倍以上。菊花中检出农药37种（超标8种，禁用7种），其次是山楂（29种）和益智（27种）。农药在根茎及根茎类药材中的检出率最高（48.62％，n=1559），在花类药材中检出率最低(5.77％，n=1559)。风险最高的农药属于有机磷杀虫剂，杀虫剂(45.42％，n=6387)和杀菌剂（33.69％，n=6387）检出率最高。 2.药用植物农残风险评估根据农残的膳食风险评估结果，10种药材的急性风险为不可接受风险(HIa＞1)，包括山楂(HIa=12.09)，花椒(HIa=11.54)，枸杞子(HIa=1.86)，和苦地丁(HIa=1.48)等。23种药用植物的慢性风险为不可接受风险(HIc＞1)，包括山楂(HIc=6.62)，肉豆蔻(HIc=3.51)，和花椒(HIc=3.38)等。山楂和花椒的急慢性风险（HQa和HQc）及急慢性累积风险（HIa和HIc）最高，而禁用农药呋喃丹和速灭磷在膳食暴露风险评估中危害商最高。此外，果实和种子类药材显示出最高的膳食暴露风险。在风险安全序数评估中，山楂、枸杞子、金银花和蒲公英中检测到的3-羟基呋喃丹和对溴磷的风险等级得分(S=140)最高。而药用植物山楂的危害指数最高(RI=1925)，其次是石斛(RI=1315)和防风(RI=1144)。此外，根据Spearman相关系数，农药残留(p=0.783)对风险排序的贡献最大，其次是农药毒性(p=0.691)，草药摄入量(p=0.370)最小。根据健康影响评估结果，药材薏苡仁(min ISh=3945.40μDALY·person-1，mean ISh=3972.07μDALY·person-1)和川明参(ISh=4287.78μDALY·person-1)调整伤残年数最高，而薏苡仁o，p''-DDT（ISi，h=2729.58μDALY·person-1），及川明参中的o,p''-DDT(mean ISi,h=2837.91μDALY·person-1,max ISi,h=3682.78μDALY·person-1)风险最高。综合三种风险评估方法，总滴滴涕、呋喃丹，和速灭磷被确认为是最具风险隐患的杀虫剂。其除具有肾毒性和肝毒性外，还具有致癌、遗传毒性、神经毒性和生殖毒性等。且山楂为代表的果实类药材的农残问题需要特别关注。 3.药用植物重金属检出及超标情况所有样品均检测到了重金属，总计30.51％(541)的样品中至少有一种重金属超过中国药典(2020版)标准，433个样品检测出一种超标金属，75个样品检测出两种超标金属，24个样品检测出种3超标金属，9个样品检测出4种超限金属。五种重金属的超标率依次为Pb(102，5.75％)＞Cd(88，4.96％)＞As(74，4.17％)＞Hg(67，3.78％)＞Cu(31，1.75％)。Hg在菊花中检出的最高浓度超标66.17倍，Pb在桔梗中检出的最高浓度超标9.02倍。叶及皮类药用植物的超标率为9.68％，果实及种子类的超标率为16.13％，全草及其它类的超标率为41.94％,根及根茎类药材的超标率为19.35％。重金属在果实和种子类药材中的检出率最高，而在全草类药材的超标率最高。重金属Pb的超标率最高，其次是Cd和As。药用植物重金属风险评估根据重金属的膳食风险评估，共有25种(29.07％)草药（n=86）存在不可接受的风险，其中9种以果实及种子入药，5种为花类，3种为根茎类，2种为叶及皮质类。7种草药中Pb、5种草药中的Cd、4种草药中的Hg和3种草药中As的最大估计日摄入量(EDI)超过了相应的暂定允许日摄入量(PTDI)。车前草的非癌症风险最高(HI=11.47)，而穿心莲的癌症风险最高(CR=5.27E-09)。重金属As在草药中显示出最高的非癌症(HQ=9.95)和癌症风险(CR=4.48E-09)。结论：农药在根茎及根茎类药材中的检出率最高，在花类药材中检出率最低，以山楂为代表的果实类药材的农残风险最高。重金属在果实和种子类药材中的检出率最高，而在全草类药材的超标率最高。风险最高的农药属于有机磷杀虫剂，总滴滴涕、呋喃丹，和速灭磷被确认为是最具风险隐患的杀虫剂。重金属As在草药中显示出最高的非癌症和癌症风险。本研究是时空尺度大规模的药用植物外源性有害残留物检测及风险评估，为标准制定、药用植物规模化生产管理体系的建立及质量监管提供了数据支撑及依据。收起

关键词 : 药用植物栽培管理外源性有害残留物风险评估药材质量

2. 中药新药治疗经前期综合征（肝气郁结、脾运失调证）临床研究

[学位论文] 谢琪北京中医药大学 2004年硕士导师: 贺兴东共378页

摘要 : 该文首先阐述了中医学对经前期综合征(又称经前期紧张综合征)的病因病机和辨证论治的相关认识,重点对近十年中医药治疗经前期综合征的研究进展进行了归纳总结,并从现代医学角度介绍了经前期综合征的发病机理、临床表现以及治疗方法的研究进展.通过分析... 展开该文首先阐述了中医学对经前期综合征(又称经前期紧张综合征)的病因病机和辨证论治的相关认识,重点对近十年中医药治疗经前期综合征的研究进展进行了归纳总结,并从现代医学角度介绍了经前期综合征的发病机理、临床表现以及治疗方法的研究进展.通过分析对照经前期综合征的主要临床表现,拟订其主要证候属于肝疏泄失常、脾运化不利所致,故将该病定位于肝、脾,定型为肝气郁结、脾运失调,以养肝解郁,理气止痛为治疗大法,从根本上治疗经前期综合征.在此基础上,通过临床试验探讨了中药新药治疗经前期综合征的疗效.试验设计采用随机、双盲、平行对照、多中心临床研究方法,以逍遥冲剂为对照药,评价中药新药治疗经前期综合征(肝气郁结、脾运失调证)的有效性和安全性.经全国5家医院药品临床试验基地对400例受试者临床试验结果表明,中药新药治疗经前期综合征(肝气郁结、脾运失调证)总有效率优于对照组逍遥冲剂,对经前期综合征的主要症状:经前情绪低落、郁闷不乐、经前乳房胀痛的改善率亦优于对照组,有显著性差异;治疗组和对照组不良事件的发生率均较低,无显著性差异.提示中药新药是治疗经前期综合征(肝气郁结、脾运失调证)安全、有效的药物.该课题科研设计合理,先后3次召开集中研讨会,由研制单位与各中心科研人员、科研管理人员共同参加,对研究方案的设计与结果进行讨论.目前,研究已全部结束,资料已完成总结报告与分报告,并完成新药申报材料,呈报国家食品药品监督管理局.研究过程规范,严格按照方案执行,由研究者委派监查员进行监查.为进一步规范操作规程,建立完善了相关的管理制度,制定了监查手册、数据管理手册.在研究过程中,在保障受试者的权益,规范化操作的同时,为了加快临床研究的进度,同时又能减轻研究者的压力,采取了广告、组织宣传会,向社会广泛征募和组织受试者的有效措施,对于促进受试者与研究人员的沟通,保证了受试者的依从性,从而保障研究工作的顺利进行起到了积极的促进作用,丰富了临床研究的形式,对于保障临床研究的质量也是一种有益而行之有效的尝试. 收起

关键词 : 经前期综合征中药新药肝气郁结脾运失调记

3. 苯基乳酸类似物的C（sp3）-H不对称羟基化酶法合成技术开发

[学位论文] 张伟杰广州中医药大学 2023年硕士导师: 廖苍松；吴杰伟共342页

摘要 : 目的：中药活性成分研究是先导化合物发现和新药研究的重要源泉。中药当中包含许多成药的明星分子，羟基酸是生物活性分子、小分子药物及天然产物中非常重要的一类结构单元，其中手性羟基引入方法是合成此类化合物急需解决的问题。而合成生物学... 展开目的：中药活性成分研究是先导化合物发现和新药研究的重要源泉。中药当中包含许多成药的明星分子，羟基酸是生物活性分子、小分子药物及天然产物中非常重要的一类结构单元，其中手性羟基引入方法是合成此类化合物急需解决的问题。而合成生物学作为一个新兴学科，是当前科学研究的热门，通过利用分子生物学和基因编辑等技术设计构建反应路径，通过高通量检测和AI学习优化重构线路发展，成为一个有机的进化整体。是解决天然产物丰度低，化学合成难的有效手段之一，生物合成途径解析，非天然氨基酸切块的生物合成，酶法后修饰应用等为天然产物的开发和应用提供新的技术。而我们也设想探索酶促反应方法及机制，合成羟基酸类化合物。所以构建高效的合成技术对药物和中药活性成分研究的绿色生物制造至关重要。本论文旨在开发建立具有高立体选择性、高区域选择性、高效率的不对称羟基化绿色合成技术。方法：本论文发现了一类α-KG依赖性的非血红素铁双加氧酶亚家族的非天然催化活性,该酶家族成员具有催化二级或三级C（sp3）-H键的区域立体发散性氧官能化的多样功能。经过大肠杆菌异源表达，蛋白纯化，酶活测定，反应条件优化，底物与酶的二维筛选扩大适用范围，产物表征以及克级制备应用，通过单晶培养及旋光测试确定手性构型。利用计算机辅助分子对接及分子动力学模拟解释反应可能的机制及不同的选择性。最终获得的不对称羟基化产物对新冠病毒Mpro/3Clpro进行抑制活性和IC50值测试。结果：本论文通过酶促反应开发建立了一套高立体选择性、高区域选择性、高效率的绿色不对称羟基合成技术。同时开发了连续不对称双羟基化合成方法技术，分别可以从苯甲醛及苯丙酸类底物出发经酶级联反应获得双羟基化产物。实现了 4种单羟基化反应类型共计92个羟基酸的高效不对称合成，其中64个新化合物;2种双羟基化反应共计38个双羟基化产物，30个新化合物。大部分产物的ee＞90％,de＞95％;极大地丰富了该类化合物的物质基础，同时为该类化合物的合成、纯化、分析、检测建立了一套行之有效的方法。本论文的部分单羟基化和双羟基化产物具有一定的抗新冠病毒活性，其中双羟基化产物的抗新冠病毒活性优于单羟基化，可作为新型冠状病毒(2019-nCoV)Mpro/3CLpro抑制剂的活性化合物进一步研究。结论：本论文通过酶促反应开发了高立体选择性、高区域选择性、高效率的不对称羟基绿色合成技术。通过灵活调整催化剂与底物的组合实现区域选择性不对称单羟基化反应，绘制了底物与酶相互反应的相关“二维谱图”;通过理论计算解释了区域选择性及立体选择性的差异，为该类酶进一步应用提供理论指导。并通过位点选择性互补催化剂的组合实现了可控的酶级联不对称双羟基化反应，构建了手性小分子羟基酸化合物库。本论文希望该酶促羟基化反应技术能够用于非天然手性小分子片段的构建和活性天然产物分子或药物分子的后期不对称修饰，服务于中药活性天然产物等小分子化合物的不对称合成，改善小分子的理化性质，为药物开发提供物质基础。收起

关键词 : 苯基乳酸类似物碳氢键酶法合成不对称催化药理作用

4. 肝毒性吡咯里西啶生物碱的代谢机制及代谢毒性相关性研究

[学位论文] 何芋岐上海中医药大学 2010年博士导师: 王峥涛;杨凌;王长虹共320页

摘要 : 吡咯里西定生物碱(pyrrolizidine alkaloids,Pas)是以双稠吡咯环为母核的一大类化合物家族。部分Pas由于具有1,2位不饱和结构,会遭受P450酶的代谢活化催化而造成肝毒性、肺毒性等。该类化合物广泛的存在于菊科、紫草科、豆科等植物中,而这些植物被广泛... 展开吡咯里西定生物碱(pyrrolizidine alkaloids,Pas)是以双稠吡咯环为母核的一大类化合物家族。部分Pas由于具有1,2位不饱和结构,会遭受P450酶的代谢活化催化而造成肝毒性、肺毒性等。该类化合物广泛的存在于菊科、紫草科、豆科等植物中,而这些植物被广泛的用于食品、茶制品、牧草原料等,引起了世界范围内的关注。同时,部分中药中也含有此类化合物,因此,Pas所致毒性对中药的国际化进程也产生了严重的负面影响。故有必要对其代谢及毒性机制进行深入研究。 Pas诱导的毒性与代谢过程密切相关,因此,Pas的代谢及其机制研究对其毒性机制研究尤为重要。Pas的各代谢机制下的代谢稳定性会因其不同的结构有所差异,并进一步对毒性产生影响,因此阐明结构-代谢-毒性间的关系将非常重要。代谢活化是导致Pas致毒的根本原因,研究代谢活化对Pas代谢稳定性的影响将直接有助于对某些Pas毒性现象的阐释。同时,除了P450酶催化的代谢活化之外,Pas还具有其他的一些代谢途径可能抑制或者阻断代谢活化的过程,进而影响Pas所致毒性。Ⅰ相代谢酶中,酯酶在这方面的作用最为明显,然而对于Ⅱ相代谢酶,相关的Pas代谢机制研究仍为空白。而系统的进行Pas的Ⅱ相代谢机制研究不仅有助于加强对Pas代谢网络的认识,更有助于研究Pas在各种代谢机制影响下的代谢稳定性与毒性的相互关系。另一方面,Pas在不同代谢机制下的代谢稳定性的相对强弱,除了取决于Pas自身的结构之外,还取决于人与动物及动物与动物之间的代谢酶系统的差异。综合分析不同种属的各代谢机制下Pas的相对代谢稳定性,将有助于从代谢机制上阐释不同种属对Pas的毒性表现差异。鉴于上述原因,本文系统的开展了Pas的Ⅰ相及Ⅱ相代谢机制研究。并通过对它们代谢机制的考察,结合毒性数据,揭示了结构与代谢、代谢与毒性间的变化规律。主要的结果和结论如下: 1.相对而言,senecionine的代谢活化效率要远远高于adonifoline,以Clint值衡量,前者(2.53μL/min/mg protein)约为后者(0.15μL/min/mg protein)的16.9倍,从根本上解释了adonifoline在毒性弱于senecionine的原因。 2.对于乙酰化的Pas,会在酯酶催化下发生乙酯键的水解,生成脱乙酰化的产物。通过isoline和clivorine的代谢机制研究,证明这是它们在人肝微粒体中的主要的代谢途径。以200μM浓度下的代谢速率进行衡量,isoline的代谢活化活性位于所有代谢途径的第二位,但仍然仅有占第一位的脱乙酰化活性的12%左右,clivorine的代谢活化活性是其脱乙酰活性的55%左右。文献报道,酯酶抑制剂可以增强isoline在小鼠体内的毒性,而雄性大鼠由于酯酶活性低于雌性大鼠也更加容易遭受clivorine的毒性攻击。而关于乙酰化Pas的脱乙酰化代谢机制的研究对乙酰化Pas的结构-毒性间的关系进行了合理的阐释。 3.通过位点阻断,senecionine的葡萄糖醛酸化代谢位点鉴定为碱基部分叔胺基团的氮原予,该结果同时被化学合成的senecionine N-glucuronide对照品所证实。进一步的实验证实Adonifoline,monocrotaline,isoline,clivorine在人肝中同样遭受N-位葡萄糖醛酸化的代谢。根据Pas葡萄糖醛酸化的位点鉴定结果,可以推测,N-葡萄糖醛酸化可能是大部分Pas的一条共有的代谢途径。 4.关于senecionine的N-葡萄糖醛酸化的代谢动力学研究给出其Clint值为3.88μL/min/mgprotein,与senecionine的代谢活化(2.53μL/min/mg protein)相比,是其约1.5倍。证明其效率高于代谢活化,是senecionine代谢网络中最为显著的代谢途径。其与毒性的相关性值得深入研究。进一步的,原代人肝细胞的细胞毒性实验表明,senecionine在50-1000μM的浓度范围内对正常的原代人肝细胞基本不表现出毒性。而当选择性抑制剂hecogenin(1,10μM)对原代人肝细胞的UGT1A4进行抑制后,senecionine对其毒性显著增大,细胞活力被抑制50%以上;表明senecionine的葡萄糖醛酸化在原代人肝细胞内可以显著的与代谢活化发生竞争,是人体抵御senecionine代谢活化致毒的重要防御机制。 5.兔体内动力学实验表明,senecionine在兔体内的主要代谢产物为senecionine N-glucuronde。该产物的体内暴露量是其原型及其他代谢产物总和的两倍之多。文献报道兔是对Pas毒性的高耐受性种属,但是通过水解和氮氧化途径都难以对此加以解释。本研究的结果证明,高的N-葡萄糖醛酸化活性是兔抵御Pas代谢活化致毒的重要防御机制。 6.通过senecionine的代谢的种属差异研究,本文将各代谢机制下的senecionine的代谢稳定性与其对不同种属的肝毒性强弱进行了良好的相关。通过拮抗系数的构建(葡萄糖醛酸化效率与代谢活化效率的比值,或者水解效率与代谢活化效率的比值),合理的反映了不同动物种属对senecionine不同毒性反应的机制。大鼠、小鼠、犬等种属具有高代谢活化活性而缺乏与之相竞争的代谢途径,因此对Pas所致肝毒性具有高敏感性。兔尽管具有一定程度的催化senecionine的代谢活化活性的能力,但是由于其具有更高的葡萄糖醛酸化活性与代谢活化相竞争(前者Clint值约为后者的6.65倍),使其免于遭受Pas的肝毒性攻击。而在豚鼠体内,担负这种拮抗代谢活化使命的代谢途径则是对senecionine的大环内酯键的水解代谢(其Clint值约为代谢活化的180倍)。 7.通过本文分析,影响Pas对人及动物毒性的因素主要包含如下几个方面,第一是Pas自身的结构,自身结构如果易于遭受代谢活化的攻击,则容易产生肝毒性,如第1点中所述。第二是体内催化Pas代谢的各种途径的相对活性的强弱,与代谢活化相竞争的高效率的代谢途径将影响到不同动物种属以及不同性别对Pas毒性反应,例如senecionine的代谢种属差异与毒性种属差异的相关性。收起

关键词 : 吡咯里西啶生物碱中药安全性 P450酶代谢活化 N-葡萄糖醛酸化葡萄糖醛酸转移酶代谢机制代谢-毒性相关性分析

5. 戊己丸提取物不同配伍组方对大鼠CYP450酶的影响研究

[学位论文] 翁小刚中国中医科学院 2010年博士导师: 朱晓新共320页

摘要 : 1.目的：研究戊己丸提取物不同配伍组方在体内对大鼠CYP450同工酶--CYP1A2、CYP3A1/3A2、CYP2A6、CYP2D6、CYP2E1酶活性的影响,在体外对CYP1A2、3A1/3A2、2A6、2C19、2D6、2E1酶活性的影响,从中药配伍与代谢酶关系方面探讨戊己丸配伍机理。 ... 展开 1.目的：研究戊己丸提取物不同配伍组方在体内对大鼠CYP450同工酶--CYP1A2、CYP3A1/3A2、CYP2A6、CYP2D6、CYP2E1酶活性的影响,在体外对CYP1A2、3A1/3A2、2A6、2C19、2D6、2E1酶活性的影响,从中药配伍与代谢酶关系方面探讨戊己丸配伍机理。 2.方法： 2.1戊己丸体外抑制大鼠肝微粒体CYP450酶活性的分析方法戊己丸由黄连、吴茱萸及白芍组成,戊己丸配伍采用L9(34)正交表设计9个戊己丸提取物不同配伍组方,3个单方。本研究表明,戊己丸提取物不同配伍组方及黄连在体外能显著抑制大鼠肝微粒体CYP450酶活性,吴茱萸及白芍抑制CYP450酶活性能力较弱。 2.1.1大鼠肝微粒体混合酶系 Wistar雄性成年大鼠,腹腔注射总剂量为210mg·kg-1的苯巴比妥钠及总剂量为160mg·kg-1的β-萘黄酮,大鼠经苯巴比妥钠及β-萘黄酮诱导CYP450酶表达及活性增加后,摘取大鼠肝脏,高速离心法制备肝微粒体,以KCl缓冲液混悬分装,-80℃保存备用。临用时肝微粒体冰浴低温解冻复苏,添加MgCl2、KCl、6-P-葡萄糖、氧化型辅酶Ⅱ等缓冲盐溶液及CYP450酶氧化还原反应所需的呼吸链递氢/电子载体,模拟体内细胞外液环境配制大鼠肝微粒体混合酶系溶液。为测定药物对CYP450同工酶活性的影响,需要将一定量的探针药(待测CYP450同工酶的专属性底物)、肝微粒体混合酶系溶液以及受试药加入同一试管进行孵育反应,反应终了通过测定探针药及代谢产物的浓度,与对照组比较,可以间接反应出该CYP450同工酶活性诱导或抑制情况。 2.1.2 CYP1A2酶活性分析方法以非那西丁为CYP1A2探针药,戊己丸每一受试药组设7个梯度浓度及溶剂对照,体外孵育管内加入受试药、非那西丁、肝微粒体混合酶系后置37℃水浴中,孵育管上面覆盖保鲜膜防止溶液挥发,孵育3h后,加入0.5mL,冰冷甲醇终止反应,转入1.5mL,离心管,4℃冰箱放置3h沉淀蛋白后,18000r·min-1离心20min,取上清液20μL，HPLC进样测定非那西丁及代谢产物--对乙酰氨基酚浓度,对乙酰氨基酚的生成量与CYP1A2酶活性呈正相关。本部分实验受试药为戊己丸提取物组方及戊己丸主要成分对照品组方,除本部分外,以下所指戊己丸受试药均指戊己丸提取物组方。非那西丁及对乙酰氨基酚的HPLC条件: Kromasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相A:5％乙腈、15％甲醇、80％水；流动相B:10％乙腈、60％甲醇、30％水；梯度洗脱程序:0min(100％A),8min(80％A,20％B),12min(60％A,40％B),20min(100％A);运行时间:40min；流速:1mL·min-1；柱温:30℃;检测波长:245nm;进样量:20μL。计算加与不加受试药物的情况下,非那西丁经CYP1A2代谢产生对乙酰氨基酚的量,首先按照以下公式计算不同浓度受试药对CYP1A2酶活性的抑制率:抑制率(％)=(不加受试药对乙酰氨基酚生成量-加受试药对乙酰氨基酚生成量)/不加受试药对乙酰氨基酚生成量×100％；然后采用改良Bliss法计算IC50值。 2.1.3 CYP3A1/3A2酶活性分析方法以睾丸酮为CYP3A1/3A2探针药,戊己丸每一受试药组设7个梯度浓度及溶剂对照,体外孵育管内加入受试药、睾丸酮、肝微粒体混合酶系后置37℃水浴中,孵育管上面覆盖保鲜膜防止溶液挥发,孵育3.5h后,加入0.5mL冰冷甲醇终止反应,转入1.5mL离心管,4℃冰箱放置3h沉淀蛋白后,18000r·min-1离心20min,取上清液20μL,HPLC进样测定睾丸酮及代谢产物--6β-羟基睾丸酮浓度,6β-羟基睾丸酮的生成量与CYP3A1/3A2酶活性呈正相关。睾丸酮及6β-羟基睾丸酮的HPLC条件: Kromasil-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相A:10％乙腈、60％甲醇、30％水:流动相B:水；流动相C:乙腈；梯度洗脱程序:0min(65％A,35％B),4.5min(65％A,35％C),8 min(65％A,35％B)；运行时间:13 min；流速:1 mL·min-1；柱温:30℃；检测波长:245 nm;进样量:20μL。计算加与不加受试药物的情况下,睾丸酮经CYP3A1/3A2代谢产生6β-羟基睾丸酮的量,按照以下公式计算不同浓度受试药对CYP3A1/3A2酶活性的抑制率:抑制率(％)=(不加受试药6β-羟基睾丸酮生成量-加受试药6β-羟基睾丸酮生成量)/不加受试药6β-羟基睾丸酮生成量×100％；然后采用改良Bliss法计算IC50值。 2.1.4 CYP2A6、2C19、2D6、2E1酶活性的cocktail探针药物分析方法以香豆素、美芬妥因、右美沙芬、氯唑沙宗为CYP2A6、2C19、2D6、2E1的混合cocktail探针药,戊己丸每一受试药组设7个梯度浓度及溶剂对照,体外孵育管内加入受试药、混合cocktail探针药、肝微粒体混合酶系后置37℃水浴中,孵育管上面覆盖保鲜膜防止溶液挥发,孵育3h后,加入0.5mL冰冷甲醇终止反应,转入1.5mL离心管,4℃冰箱放置3h沉淀蛋白后,18000r·min-1离心20min,取上清液2μL,LC-MS进样测定4种探针药的代谢产物--7-羟基香豆素、4-羟基美芬妥因、右啡烷及6-羟基氯唑沙宗的生成浓度,该4种代谢产物的生成量与相应的CYP450同工酶活性呈正相关。 7-羟基香豆素、4-羟基美芬妥因、右啡烷及6-羟基氯唑沙宗的LC-MS条件:Clipeus-C8色谱柱(30mm×2.1mm,5μm)；流动相A:水；流动相B:甲醇；流动相C:5mM醋酸铵；梯度洗脱程序:0min(90％A,10％B),1.0min(90％A,10％B)、2.0min(60％A,40％B)、3.5min(60％A,40％B)、3.51min(40％B,60％C)、4.5min(60％B,40％C)、4.51min(40％A,60％B)、5.0min(20％A,80％B)、6.0min(20％A,80％B)、6.01min(90％A,10％B)、8.0min(90％A,10％B)；运行时间:8min；流速:0.2mL·min-1；柱温:25℃；进样量:2μL；MS:ESI离子源,Drying Gas Flow:10L·min-1;Drying Gas Tem:350℃；正负离子模式同时检测,MRM扫描模式:7-羟基香豆素,163-189正离子；4-羟基美芬妥因,201-230负离子；右啡烷,269-233正离子；6-羟基氯唑沙宗184-184负离子。计算加与不加受试药物的情况下,探针药经相应CYP450同工酶代谢产生7-羟基香豆素、6-羟基氯唑沙宗、4-羟基美芬妥因及右啡烷的量,按照以下公式计算不同浓度受试药对CYP450同工酶活性的抑制率:抑制率(％)=(不加受试药探针药代谢产物生成量-加受试药探针药代谢产物生成量)/不加受试药探针药代谢产物生成量×100％；然后采用改良Bliss法计算IC50值。 2.2戊己丸配伍体内对大鼠CYP450酶活性影响分析方法 2.2.1大鼠体内CYP1A2酶活性分析方法 CYP1A2底物——非那西丁大鼠灌胃给药后,HPLC测定大鼠血循环中不同时间点的非那西丁、对乙酰氨基酚(非那西丁经CYP1A2代谢后的产物)浓度变化,以非那西丁、对乙酰氨基酚在给受试药物(本论文实验为戊己丸提取物不同配伍组方)前后药动学信息参数的变化推导受试药在体内对动物的CYP1A2酶活性影响。非那西丁、对乙酰氨基酚浓度的HPLC测定条件同体外CYP1A2酶活性分析方法。 2.2.2大鼠体内CYP3A、2A6、2D6、2E1酶活性分析方法采用CYP3A、CYP2A6、CYP2D6、CYP2E1专属性底物--睾丸酮、香豆素、右美沙芬及氯唑沙宗混合cocktail探针药物大鼠灌胃给药后,LC-MS测定大鼠血循环中不同时间点的睾丸酮/6-羟基睾丸酮(代谢产物)、香豆素/7-羟基香豆素(代谢产物)、右美沙芬/右啡烷(代谢产物)及氯唑沙宗/6-羟基氯唑沙宗(代谢产物)浓度变化,以上述探针药及代谢产物药对在给受试药物(本论文实验为戊己丸提取物不同配伍组方)前后药动学信息参数的变化推导受试药在体内对动物CYP3A、CYP2A6、CYP2D6、CYP2E1酶活性的影响。收起

关键词 : 戊己丸 CYP450 cocktail探针药物 LC-MS 中药配伍药动学

6. 葶苈子综合质量评价体系的构建（下）

[学位论文] 马梅芳山东中医药大学 2009年博士导师: 石俊英共316页

摘要 : 课题在中医药学的整体理念和思维体系的指导下，充分依托先进的现代科学技术与分析实验手段，在对葶苈子本草考证、现代文献整理和实地调研的基础上，从生药学研究、薄层色谱鉴别、检查项目测定、浸出物测定、有效部位含量测定、有效成分含量测定、指... 展开课题在中医药学的整体理念和思维体系的指导下，充分依托先进的现代科学技术与分析实验手段，在对葶苈子本草考证、现代文献整理和实地调研的基础上，从生药学研究、薄层色谱鉴别、检查项目测定、浸出物测定、有效部位含量测定、有效成分含量测定、指纹图谱研究、主要药效学研究几个方面对不同品种、不同产地、不同生长环境的多个葶苈子样品进行多指标、多组分、多角度、多层次的质量控制系统研究。从外部形状、大小、色泽、表面特征、质地、气味几个方面进行性状分析；从黏液层、横切面及粉末特征几个方面进行显微鉴定；通过实验建立以芥子碱硫氰酸盐为对照品的薄层色谱鉴别方法；在膨胀度检查的基础上，增加水分和灰分检查；分别采用冷浸法、热浸法测定水溶性和醇溶性浸出物的含量，并对样品是否需要粉碎进行比较研究；采用重量法测定脂肪油的含量，并通过皂化值、碘值、酸值和过氧化值的测定，对葶苈子脂肪油的性质进行综合分析与评价；采用酸性染料分光光度法，建立葶苈子中总生物碱的含量测定方法；采用三氯化铝显色分光光度法，建立葶苈子中的总黄酮的含量测定方法；采用水提醇沉法提取葶苈子多糖，并用硫酸蒽酮法测定多糖的含量；采用高效液相色谱法建立葶苈子中芥子碱硫氰酸盐、槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量测定方法；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，建立葶苈子的蛋白质、同工酶电泳指纹图谱；采用不同极性的多溶剂系统（包括石油醚、氯仿、无水乙醇、水）的提取液，建立葶苈子的紫外谱线指纹图谱；从镇咳、祛痰、利尿、抗炎、免疫、抗肿瘤、急性毒性实验几个方面对葶苈子的主要药效学进行研究。课题采用化学成分指标与药理活性指标相结合的研究思路与方法，定性分析与定量测定相结合，单一成分定量分析与有效部位总量控制相结合，生物技术、色谱技术与光谱技术相结合，药理有效性指标与毒理安全性指标相结合的质量评价模式，强调葶苈子的整体性、综合性特征，体现了传统中医药理论与现代科学技术的紧密结合。探索建立了符合中药特点的、质-效相关性强的、科学规范的葶苈子的综合质量评价体系。收起

关键词 : 葶苈子质量评价有效成分含量测定药效学

7. 南重楼和毛重楼的化学成分研究

[学位论文] 刘杨空军军医大学 2018年博士导师: 汤海峰共312页

摘要 : 重楼属(Park)植物是一种多年生草本植物，现有一部分专家认为该属植物属于延龄草科(Trilliaceae)，但多数人认为应归为百合科(Liliaceae)。重楼属植物共有26种14余变种和若干变型，我国约有20种10余变种，主要分布于欧洲和亚洲，在我国西南地区含有丰... 展开重楼属(Park)植物是一种多年生草本植物，现有一部分专家认为该属植物属于延龄草科(Trilliaceae)，但多数人认为应归为百合科(Liliaceae)。重楼属植物共有26种14余变种和若干变型，我国约有20种10余变种，主要分布于欧洲和亚洲，在我国西南地区含有丰富的野生资源。现已有研究表明重楼属植物具有较高的药用价值如抗肿瘤、抗菌、止血等。本课题选取南重楼(Paris vietnamensis)与毛重楼(Paris mairei)为研究对象，对两种植物的成分进行系统研究。通过正相娃胶层析柱、Sephadex LH-20分子筛凝胶柱、ODS反相柱层析及半制备HPLC等方法分离纯化，借助现代波谱分析技术对分离得到的天然产物进行结构鉴定，最终得到61个化合物，包括17个新化合物，且有4个苷元结构是首次发现。选取三个神经胶质瘤细胞系(U251,U87MG和SHG44)，采用MTT对分离得到的化合物进行初步生物活性筛选。研究成果展示如下： 1.南重楼的化学成分研究：对2kg南重楼根茎依次用70%乙醇提取、水饱和正丁醇萃取后分离纯化并鉴定34个单体化合物，其中有9个新化合物。化合物结构依次为：（此处为公式省略）。其中包括6个非甾体类化合物，2个甾酮类化合物，26个甾体皂苷类化合物。化合物N-9，N-10，N-18，N-27?N-29，N-32-N-34为新化合物，且化合物N-10，N-27，N-29的苷元是首次发现，化合物N-6，N-24，N-26，N-30,N-31均是首次从重楼属植物中分离得到。 2.毛重楼的化学成分研究：对1kg南重楼根茎依次用70%乙醇提取、水饱和正丁醇萃取后分离纯化并鉴定27个单体化合物，其中有8个新化合物。化合物结构依次为：（此处为公式省略）。其中包括14个螺甾烷型皂苷类化合物（其中M-23?M-27分别与南重楼中化合物N-10，14，15，23，31结构相同），7个呋甾烷型皂苷类化合物，6个五环三萜皂苷类化合物。经Scifinder数据检索，化合物M-2，M-4，M-6，M-9，M-10，M-15，M-17，M-18为新化合物，化合物M-10的苷元是首次发现。化合物M-1，M-7，M-8，M-14均是首次从重楼属植物中分离得到。 3.抗肿瘤活性测试选取三种神经胶质瘤细胞株U87MG、U251MG和SHG44对分离得到的48个皂苷类化合物进行细胞毒性实验，筛选出一批有活性的化合物，其中化合物N-14，15，16，17，22，24?26，M-1对神经胶质瘤细胞具有显著活性，并对其构效关系进行了初步讨论。课题创新性及研究意义： 1.对重楼属两种植物南重楼和毛重楼的化学成分进行了系统研究，共分离鉴定61个化合物，其中包括47个甾体皂苷成分，6个五环三萜类成分和8个非甾类化合物； 2.发现了17个新化合物，其中有4个化合物的苷元是首次发现，9个化合物首次从重楼属中分离； 3.通过体外抗神经胶质瘤活性筛选，在多样化结构的基础上总结出有意义的重楼甾体皂苷结构与效应的规律，为甾体皂苷的抗胶质瘤研究及结构修饰优化提供理论依据，为解决重楼甾体皂苷的应用前途提供借鉴； 4.本课题为寻找替代重楼属植物基源植物的化学成分提供了资源，为发掘作用确切的新型胶质瘤化疗先导化合物提供依据，形成自主知识产权，具有潜在的社会效益和经济效益；收起

关键词 : 重楼属化学成分南重楼毛重楼甾体皂苷三萜皂苷抗肿瘤活性

8. 基于多组学技术探究黄芩汤干预结肠炎相关结直肠癌的作用机制

[学位论文] 马旭冉中国中医科学院 2022年博士导师: 杨伟鹏共303页

摘要 : 1研究背景与目的虽然结肠炎相关结直肠癌(Colitisassociatedcolorectalcancer，CAC)的发病机制尚未完全明确，但疾病从发生至发展均与炎症密切相关。近年来有大量研究表明，炎症性肠病(InflammatoryBowelDisease，IBD)是诱发结肠癌的重要危险因... 展开 1研究背景与目的虽然结肠炎相关结直肠癌(Colitisassociatedcolorectalcancer，CAC)的发病机制尚未完全明确，但疾病从发生至发展均与炎症密切相关。近年来有大量研究表明，炎症性肠病(InflammatoryBowelDisease，IBD)是诱发结肠癌的重要危险因素，与健康人群相比，克罗恩病(Crohn''sdisease，CD)和溃疡性结肠炎(UlcerativeColitis，UC)等IBD患者罹患结肠癌的风险更高。慢性炎症会导致结肠黏膜的遗传损伤，使自身组织过度修复，肠上皮细胞增生异常，最终恶化为结肠癌。前期研究发现黄芩汤(HQT)具有多途径的、效应明确的抗炎、抗氧化应激作用机制，本实验基于“HQT可能通过调控细胞周期紊乱、上皮间质转化异常并诱导肿瘤细胞焦亡等机制及相关靶标来干预CAC”的假说，构建CAC动物模型与体外细胞模型，在体内-体外-分子水平分别对HQT的药效进行整体评价，将蛋白质组及转录组预测筛选、组织病理学与分子生物学验证等多学科技术相交叉，深入结合基因、蛋白等多个层面，寻找HQT干预CAC的关键信号分子、疾病标志物、药物作用靶点等，探讨HQT对CAC的药效作用及其相关的机制。 2研究方法与结果 2.1体内动物模型构建与行为学评价利用氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)与硫酸葡聚糖(DextranSulphate，DSS)联合诱导构建CAC小鼠模型，按体重将小鼠随机分为正常组(Normal)、模型组(Model)、阳性药柳氮磺胺吡啶组(SASP)、黄芩汤高剂量组(HQT-H)、黄芩汤中剂量组(HQT-M)、黄芩汤低剂量组(HQT-L)，对除正常组以外的其他组别小鼠进行造模，根据后续的行为学表现评价CAC模型制备成功;长期灌胃给予阳性药SASP与高、中剂量HQT后的小鼠腹泻与便血情况均有所改善、恢复期内的体重回升情况优于模型组小鼠。 2.2CAC小鼠模型组织病理学评估造模给药完成后，解剖小鼠取结肠组织，HE染色后镜下观察发现，持续给予SASP的小鼠结肠隐窝与绒毛的结构破坏与紊乱有所改善，炎症浸润程度减轻;长期给予HQT可改善CAC小鼠结肠紊乱的腺体排列，减轻腺体结构损坏程度。 2.3Luminex法检测CAC模型小鼠血清中炎性因子含量取各组小鼠血清进行Luminex多因子检测后发现，模型组小鼠血清内IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著高于正常组(p＜0.01);与模型组相比，阳性药SASP组与高剂量HQT组小鼠血清内IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著降低(p＜0.01);中剂量HQT组小鼠血清内IL-1α、IL-1β、IL-6含量显著低于模型组(p＜0.01），TNF-α含量显著低于模型组(p＜0.05）;低剂量HQT组小鼠血清内IL-1α含量显著低于模型组(p＜0.01)，IL-1β、IL-6含量显著低于模型组(p＜0.05)，TNF-α含量降低但未见显著性差异。 2.4Luminex法检测CAC模型小鼠血清中基质金属蛋白酶含量取各组小鼠血清进行取各组小鼠血清进行Luminex多因子检测后发现，模型组小鼠血清内MMP-2、MMP-9含量均显著高于正常组(p＜0.01）;与模型组小鼠相比，阳性药SASP组与高剂量HQT组小鼠血清内MMP-2、MMP-9含量均显著降低(p＜0.01);中剂量HQT组小鼠血清内MMP-2含量显著低于模型组(p＜0.01)，MMP-9含量降低但未见显著性差异;低剂量HQT组小鼠血清内MMP-2、MMP-9含量均降低，但未见显著性差异。 2.5TMT标记法定量检测小鼠结肠组织蛋白质组对小鼠结肠组织进行高通量筛选并行组间比较后发现，显著性差异蛋白为CyclinD1、WNT3A、β-catenin、Cdk4、Nlrp6、Fer、Cdhr5、E-cadherin、Fam98b、GSK3β、Sis等;GO功能注释显示细胞成分(CC)主要包括后期促进复合物、细胞外间隙、纤维蛋白原复合物等;分子功能(MF)为钙离子结合、金属内肽酶活性、细胞外基质结构成分等;生物过程(BP)涉及细胞成分组织的调节、细胞代谢过程的调节、凋亡过程的调节等。校正筛选后的KEGGPathway为WNTsignalingpathway、Jak-STATsignalingpathway、Cellcycle等。结构域富集发现，模型组小鼠与正常组小鼠的主要差异在于Sodium/solutesymporter、Terpenoidcyclases/proteinprenyltransferasealpha-alphatoroid以及Alpha-macroglobulin补体成分等。蛋白互作信筛选后发现具有相互作用的蛋白质是WNT3A，GSK3β，Cdk4,CyclinD1,E-cadherin,β-catenin。 2.6体内动物模型验证相关蛋白靶点 2.6.1Western-Blot法验证CAC模型小鼠结肠组织差异蛋白蛋白表达取各组小鼠结肠组织进行Western-Blot印迹法蛋白检测后发现，模型组小鼠结肠组织内E-cadherin、GSK3β含量均显著低于正常组(p＜0.01)，β-catenin、Cdk4、CyclinD1、WNT3A含量均显著高于正常组(p＜0.01);与模型组小鼠相比，阳性药SASP组、高剂量HQT组小鼠结肠组织内E-cadherin、GSK3β含量均显著升高(p＜0.01），CyclinD1、Cdk4、WNT3A含量均显著降低(p＜0.01）;中剂量HQT组小鼠结肠组织内E-cadherin、GSK3β含量均显著高于模型组(p＜0.01)，β-catenin、WNT3A含量均显著低于模型组(p＜0.05);低剂量HQT组小鼠结肠组织内E-cadherin含量显著高于模型组(p＜0.05)，其余指标未见显著性差异。 2.6.2qPCR法验证CAC模型小鼠结肠组织差异蛋白mRNA表达提取小鼠结肠组织内的总RNA并反转录后进行qPCR定量检测后发现，与模型组小鼠相比，所有给药组小鼠结肠组织内E-cadherin、GSK3βmRNA表达量均显著升高(p＜0.01)，CyclinD1、Cdk4、β-catenin、WNT3AmRNA表达量均显著降低(p＜0.01）。 2.7体外细胞模型验证相关蛋白靶点 2.7.1细胞模型构建与给药浓度筛选利用LPS刺激结肠上皮细胞ICE-6构建结肠炎症模型，利用LPS刺激巨噬细胞THP-1制备条件培养基，使用该条件培养基培养结肠癌细胞HT-29构建HT-29/THP-1结肠炎癌模型。采用MTT法对给药前后细胞活力进行测定后，选用500μg·mL-1，250μg·mL-1，125μg·mL-1浓度梯度的HQT进行后续实验。 2.7.2Elisa法检测结肠炎症模型炎性因子含量使用LPS刺激IEC-6细胞后，模型组中IL-1β、TNF-α含量显著高于空白组(p＜0.01)，表明IEC-6炎症模型构建成功;与模型组相比，HQT各浓度给药组内IL-1β、NF-α含量均显著降低(p＜0.01)。 2.7.3Transwell法检测结肠炎癌细胞模型迁移能力对Transwell小室计数后发现，与空白组相比，HQT高剂量组与中剂量组细胞数目均显著减少(p＜0.01);HQT低剂量组细胞数目减少但未见显著性差异。 2.7.4Transwell法检测结肠炎癌细胞模型侵袭能力对Transwell小室计数后发现，与空白组相比，HQT高剂量组与中剂量组细胞数目均显著减少(p＜0.01);HQT低剂量组细胞数目减少但未见显著性差异。 2.7.5Western-Blot法验证细胞模型差异蛋白蛋白表达提取IEC-6结肠炎症模型内总蛋白进行Western-Blot印迹法蛋白定量检测后发现，模型组细胞内E-cadherin、GSK3β表达均显著低于空白组(p＜0.01)，CyclinD1、Cdk4、β-catenin、WNT3A表达均显著高于空白组(p＜0.01);与模型组相比，高剂量HQT组细胞内E-cadherin、GSK3β表达均显著升高(p＜0.01)，CyclinD1、Cdk4表达均显著降低(p＜0.01)，WNT3A表达显著降低(p＜0.05）;中剂量HQT组细胞内E-cadherin表达显著升高(p＜0.01)，GSK3β表达升高(p＜0.05)，CyclinD1、Cdk4表达显著降低(p＜0.05)，β-catenin与WNT3A表达降低但未见显著性差异;低剂量HQT组细胞内E-cadherin表达显著升高(p＜0.01)，GSK3β表达升高(p＜0.05)，CyclinD1与Cdk4表达降低(p＜0.05)，β-catenin与WNT3A表达降低但未见显著性差异。提取HT-29/THP-1炎癌细胞模型内总蛋白进行Western-Blot印迹法蛋白检测后发现，与空白组相比，HQT高剂量与中剂量组细胞内E-cadherin、GSK3β表达均显著升高(p＜0.01)，CyclinD1、β-catenin、Cdk4、WNT3A表达均显著降低(p＜0.01);HQT低剂量组细胞内E-cadherin表达显著升高(p＜0.01)，GSK3β表达升高但未见显著性差异，CyclinD1、β-catenin、Cdk4、WNT3A含量均降低但未见显著性差异。 2.7.6qPCR法验证细胞模型差异蛋白mRNA表达提取IEC-6结肠炎症模型内总RNA并反转录后进行qPCR定量检测后发现，与模型组相比，三种剂量HQT组细胞内E-cadherin、GSK3βmRNA表达量均显著增加(p＜0.01);高剂量组E-cadherin、Cdk4、β-catenin、WNT3AmRNA表达量均显著减少(p＜0.01);中剂量组E-cadherin、Cdk4、β-cateninmRNA表达量均显著减少(p＜0.01)，WNT3AmRNA表达量显著减少(p＜0.05);低剂量组E-cadherin、β-cateninmRNA表达量均显著减少(p＜0.01)，Cdk4、WNT3AmRNA表达量减少但未有统计学差异。提取HT-29/THP-1炎癌细胞模型内总RNA并反转录后进行qPCR定量检测后发现，与低剂量HQT组相比，高剂量组细胞内E-cadherin、GSK3βmRNA表达量均显著增加(p＜0.01），CyclinD1、Cdk4、β-cateninmRNA表达量均显著减少(p＜0.01)，WNT3AmRNA表达量减少(p＜0.05）;中剂量HQT组GSK3βmRNA表达量显著增加(p＜0.01)，E-cadherinmRNA表达量增加但未见显著性差异，CyclinD1、β-cateninmRNA表达量均显著减少(p＜0.05)，Cdk4、WNT3AmRNA表达量减少但未见显著性差异。 2.8真核无参转录组检测小鼠结肠转录本提取小鼠结肠组织内的总RNA并反转录后进行qPCR定量检测后发现，将高质量数据拼接后得到的转录本进行定量分析与功能注释。对鉴定到的基因进行组间比较后发现，具有显著性差异的基因为Nlrp3、ASC、Caspase-1、GSDMD、IL-18、AIM2、Jak2、STAT3、Errfi1、EGFR、CD44、Cldn-1、App、Agr2、Krt17、Jun、Mpc1、Nat2、Lrrc15、Optn等。GO功能注释显示细胞成分(CC)主要包括白细胞介素1受体复合物、线粒体内膜蛋白复合物、紧密连接等;分子功能(MF)为结构分子活性、肿瘤坏死因子受体结合、细胞因子受体收起

关键词 : 结肠炎相关结直肠癌蛋白组学转录组学上皮间质转化细胞焦亡

9. 四十种中药饮片等级评价研究

[学位论文] 石佳中国中医科学院 2020年硕士导师: 刘安共295页

摘要 : 中药材及饮片的商品规格等级伴随中药交易的发展而产生，自古以来就“看货评级，分档定价”的质量观，早在西汉时期《范子计然》中就有80多个品种的商品规格。然而如今实行的标准《七十六种药材商品规格标准》随着产地变迁、市场变化等种原因己然难以... 展开中药材及饮片的商品规格等级伴随中药交易的发展而产生，自古以来就“看货评级，分档定价”的质量观，早在西汉时期《范子计然》中就有80多个品种的商品规格。然而如今实行的标准《七十六种药材商品规格标准》随着产地变迁、市场变化等种原因己然难以适应当今市场。且中药饮片是中药行业的重要支柱之一，是中药制剂、中成药等主要原料，其优劣对临床疗效有着直接影响。诸多国家标准中与等级划分相关的内容鲜少体现饮片的特点，许多评价项都采用“同药材”的描述，饮片的等级评价基本处于空白。如今，市场上饮片规格混乱、以次充好、低价当道等不良现象对饮片产业的健康发展造成了恶劣的影响。因此，挖掘、研究、制定适合中药饮片的，科学合理且使用简便的等级评价方法对中医药行业的健康发展具有重要意义。一个科学合理的方法的建立需要开展大量的前期准备工作。本文通过查阅相关古籍、文献、国家标准梳理出当前饮片质量评价及等级划分的三种主要方法：一种主观经验性评价方法，即通过饮片的大小、质地等性状特征对饮片等级进行划分;第二种则是对指标成分含量检测的现代评价方法;第三种则是将以上两者相结合的综合论。对三种方法各具的特点、优势、不足进行总结、比较及分析。在文献调查的基础上，笔者前往分别位于国内中部、南部、北部的三个大型药材市场对中药饮片等级划分的现状及市场需求进行调研，进一步挖掘中药饮片等级划分的市场需求。市场调研结果显示针对市场上饮片的质量是有好有坏的情况，市场亟需一个科学、客观、利于推广与传承的将传统方式与指标成分相结合的中药饮片等级划分方法作为技术支撑，使等级划分达到保障临床疗效、实现优质优价、保障大众对饮片选择权的理想状态。除此以外，本文也就调研过程中所发现的行业现存的问题提出一些建议。中药饮片的品质内涵是其内在质量与外在质量的综合体现，结合文献及市场调研结果可知影响中药饮片质量的内外因素众多。在众多的指标中选择合适的参数是建立方法的首要工作。本文认为为了体现饮片的差异，等级评价方法中所选取的指标应在合格饮片的标准上，尽量避免使用合格饮片的共性指标，以便进行等级划分。且部分指标间可能存在相关性会因重复评价而影响评价结果，且纳入全部评价指标也增加评价的复杂性，难以达到“可行性强”的特点。故将这些参数间的因果关系进行分析，筛选出必要的评价指标对该方法的建立有着至关重要的作用。在前期工作的基础上，本文建立了质量常数等级划分方法。即从饮片品种特点出发，以古籍、文献、国家标准、市场流通情况为依据，将传统性状评价标准及内在指标质控评价指标进行有机整合，选取必要且合理的等级评价指标，根据不同饮片形态及切制情况，包括顶刀片(如莪术)、顺刀片(如天麻)、条形片(如合欢皮)、块状片(如葛根)、不规则片(如土茯苓)、类球形片(如栀子)、其他整体饮片(如款冬花)、无形态饮片(如薄荷)，经过三维数学建模，形成了不同的质量常数、相对质量常数、百分质量常数等计算方法，将百分质量常数以从大到小的顺序进行排序，根据市场等级划分习惯，将中药饮片等级分为三等，其中一等品百分质量常数≥80，二等品百分质量常数＜80且≥50，三等品百分质量常数＜50。最终将饮片质量特征转换为具体数值予以表征、比较。利用所建立的方法对不同饮片形态的40种中药饮片及其部分炮制品进行等级划分，得到了有效的划分结果。本文进一步对各个饮片的等级划分结果进行深入的分析;对同类形态饮片指标、公式的选择规律进行明确;对质量常数等级评价方法与传统形态等级评价的关联进行考察与验证，对整套等级评价方法进行整理及优化。以栀子为例，通过不同等级栀子片对LPS诱导的RAW264.7细胞NO产生的抑制作用，建立了栀子饮片等级与疗效的关系以验证该方法的科学性[2]。单味饮片等级与药效间关系的考察是不够的，需要进一步明确该方法划分出的等级差异能否进一步转化为临床主要用药形式，即中药复方的药效强弱。本文以大川芎方为例，将不同等级的川芎、天麻饮片组成的不同等级复方以体外血管舒张率为主要药效学指标，探讨质量常数等级评价方法对川芎、天麻饮片进行了有效的等级划分的同时是否对其组成的复方药效也有一定的关联和提示作用，继而为饮片的优质优效提供有力的科学依据。结果表明三种“等级”的单味饮片与复方的药效均随等级的降低而降低，药效强弱与饮片的等级成正相关。质量常数等级评价方法实现了传统主观经验与现代质控指标的有机结合;实现了清晰明了、简单易行公式的建立;实现了丰富数据不受人为、时间、空间限制，实现了等级评价的全程量化，更利于分析、比较、传承。该方法虽然具备以上优点，但由于时间有限，以上研究旨在为该方法搭建框架，仍有不足之处，如对评价指标的选取上，对样品的收集上等方面仍有待迸一步补充及改善。该等级评价方法的建立以解决中药饮片等级评价工作中的现存问题为出发点，为推动中药饮片分级评价进程，引导市场规范化运作，实现优质优价，促进中药饮片产业健康发展，保障大众健康权益，建设中药标准化体系提供新的思路、新的思考。收起

关键词 : 中药饮片质量评价等级划分

10. 生地黄化学成分研究

[学位论文] 李孟河南中医学院 2014年硕士导师: 冯卫生;郑晓珂;王小兰共295页

摘要 : 目的：地黄为玄参科植物 Scrophulariaceae地黄 Rehmannia glutinosa的新鲜或干燥块根，始载于《神农本草经》，列为上品,是河南“四大怀药”之一。根据炮制方法和临床功用的不同，地黄可以分为鲜地黄、生地黄、熟地黄，采收后的鲜地黄烘焙至八成干即... 展开目的：地黄为玄参科植物 Scrophulariaceae地黄 Rehmannia glutinosa的新鲜或干燥块根，始载于《神农本草经》，列为上品,是河南“四大怀药”之一。根据炮制方法和临床功用的不同，地黄可以分为鲜地黄、生地黄、熟地黄，采收后的鲜地黄烘焙至八成干即得到生地黄。生地黄性寒，味甘，具有清热凉血，养阴生津的功效。现代药理学表明，生地黄具有很好的降血糖、抗衰老、保肝等作用。在本实验室前期研究中，生地黄水提物具有雌激素及免疫调节作用，为了达到量减效增的目的，采用95%乙醇药渣回流水提法，对其发挥作用的有效部位进了筛选，最终发现，生地黄95%乙醇提取物具有雌激素样及免疫抑制作用；粗多糖成分为发挥免疫增强作用的有效部位。为明确生地黄发挥雌激素及免疫抑制活性的物质基础,特对其95%乙醇提取物进行系统的化学成分研究。方法：生地黄20Kg，购自河南省焦作市温县，采用95%乙醇回流提取法，于78℃用10倍量95%乙醇加热回流提取两次,每次2h，提取液减压浓缩至无醇味(约3000mL)，得到95%乙醇浓缩液。浓缩液经离心过滤，上 Diaion HP-20柱，分别用水和甲醇洗脱，得到水部位和甲醇部位(101.2g)。甲醇部位用10%甲醇溶液离散溶解，离心过滤，滤液再次上 Diaion HP-20柱，依次用10倍量的10%、30%、50%、70%、100%甲醇溶液梯度洗脱。得到的各洗脱部位利用硅胶、Toyopearl HW-40、Sephadex LH-20、MCI Gel CHP、Silica Gel等柱层析填料进行分离纯化，并结合重结晶及制备液相，得到各单体化合物；采用化学和波谱学等方法，对化合物的结构进行鉴定。结果：从生地黄95%乙醇提取物中共分离并鉴定了58个化合物的结构。其中，环烯醚萜类化合物11个：筋骨草醇(SDH-1-1)，地黄苷 D(SDH-1-15)，梓醇(SDH-1-16)，10-deoxyeucommiol(SDH-1-17)，地黄新萜 H(SDH-10)，8-表番木鳖酸(SDH-15)，6-O-香草酰基筋骨草醇(SDH-5-2)，jiofuraldehyde dimethyl acetal(SDH-5-5)，6-O-E-feruloyl ajugol(SDH-5-10)，6-O-(4′′-O-α-L-rhamnopyranosyl) vanilloyl ajugol(SDH-5-21)，6-O-sec-hydroxyaeginetoyl ajugol(SDH-7-10)；紫罗兰酮类化合物11个：地黄紫罗兰苷 C(SDH-1-14)，rehmapicrogenin(SDH-2)，3-methoxy-2,6,6-trimethylcyclohex-1-enecarboxylic acid(SDH-3)，rehmapicrogenin A(SDH-4)，地黄新萜 G(SDH-8)，地黄苦苷(SDH-9)，地黄紫罗兰苷 A(SDH-12)，5-羟基野菰酸(SDH-25)，frehmaglutin B(SDH-5-11)，trihydroxy-β-ionone(SDH-5-19)，dihydroxy-β-ionone(SDH-7-6)；苯乙醇苷类化合物7个：leonoside F(SDH-7)，海胆苷(SDH-13)，对羟基苯乙醇苷(SDH-26)，地黄苷(SDH-5-13)，毛蕊花糖苷(SDH-5-17)，异毛蕊花糖苷(SDH-5-18)，焦地黄苯乙醇苷B1(SDH-5-20)；木脂素类化合物4个：地黄新木脂素 A(SDH-27a)，地黄新木脂素 B(SDH-27b)，trans-liovil(SDH-5-3)，(7R,8S)-4,9,3′-三羟基-3-甲氧基-7,8-二氢苯骈呋喃-1′-丙醛基新木脂素(SDH-7-2)；苯丙素类化合物6个：guaicylglycerol(SDH-18)，7-O-ethyl guaiacylglycerol(SDH-19)，coniferin(SDH-30)，阿魏酸甲酯(SDH-5-6)，对羟基桂皮酸甲酯(SDH-5-7)，3-甲氧基-4-羟基桂皮醛(SDH-7-1)；其他类成分19个：pterolactam(SDH-1-3)，1,2,4-苯三酚(SDH-1-9)，腺嘌呤核苷酸(SDH-1-10)，鸟嘌呤核苷酸(SDH-1-12)，rhamnopyranosyl vanilloyl(SDH-14a)，syringicacid-4-O-α-L-rhamnopyranoside(SDH-14b)，4-[2′-formyl-5′-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-1-yl)] butanoic acid(SDH-16)，l,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid(SDH-21)，丁香酸(SDH-28)，对羟基苯乙酸(SDH-29)，3-吲哚甲酸(SDH-5-14)，9,12,13-三羟基-10-十八烯酸(SDH-7-3)，胡萝卜苷(SDH-m-1)，5α,6β-二羟基胡萝卜苷(SDH-m-3)，油酸(SDH-m-5)，邻苯二甲酸二丁酯(SDH-m-5a)，β-谷甾醇(SDH-m-7)，Diincarvilone A(SDH-m-9)，glutinosalactone A(SDH-m-10)。结论：从生地黄中共分离得到到58个化合物，其中4个新化合物，17个首次分离得到。新化合物分别是：地黄新萜 G(SDH-8)，地黄新萜 H(SDH-10)，地黄新木脂素 A(SDH-27a)，地黄新木脂素 B(SDH-27b)。首次从中分到的化合物是：pterolactam(SDH-1-3)，鸟嘌呤核苷酸(SDH-1-12)，10-deoxyeucommiol(SDH-1-17)，leonoside F(SDH-7)，4-[2′-formyl-5′-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-1-yl)] butanoic acid(SDH-16)，7-O-ethyl guaiacylglycerol(SDH-19)，l,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid(SDH-21)，coniferin(SDH-30)，trans-liovil(SDH-5-3)，jiofuraldehyde dimethyl acetal(SDH-5-5)，阿魏酸甲酯(SDH-5-6)，对羟基桂皮酸甲酯(SDH-5-7)，3-吲哚甲酸(SDH-5-14)，3-甲氧基-4-羟基桂皮醛(SDH-7-1)，(7R,8S)-4,9,3′-三羟基-3-甲氧基-7,8-二氢苯骈呋喃-1′-丙醛基新木脂素(SDH-7-2)，5α,6β-二羟基胡萝卜苷(SDH-m-3)，Diincarvilone A(SDH-m-9)。收起

关键词 : 生地黄化学成分乙醇提取物免疫调节