摘要: 目的：近年研究发现，SHH信号通路参与了多种动物缺血模型中的血管再生，包括脑缺血，骨骼肌缺血、角膜及肢体缺血等。然而，SHH信号通路在心肌缺血再灌注中的研究却很少，并且给予重组人SHH蛋白干预是否对心脏微血管内皮细胞具有保护作用及其潜在作用... 展开 目的：近年研究发现，SHH信号通路参与了多种动物缺血模型中的血管再生，包括脑缺血，骨骼肌缺血、角膜及肢体缺血等。然而，SHH信号通路在心肌缺血再灌注中的研究却很少，并且给予重组人SHH蛋白干预是否对心脏微血管内皮细胞具有保护作用及其潜在作用机制是否与激活SHH-Patched-SMO-Gli信号通路有关尚无文献报道。而且SHH在急性心肌梗死后冠状动脉侧枝循环的形成中发挥何种作用及其机制尚无相关研究。因此，我们将从以下方面探讨： 1.研究重组人SHH蛋白对CMECs细胞凋亡与增殖的影响，探讨SHH信号通路激活对大鼠 CMECs缺血再灌注损伤后促血管再生的作用及其潜在机制，为临床上心肌缺血再灌注损伤的防治提供理论依据。 2.探讨急性心肌梗死患者冠状动脉侧枝循环建立与血浆SHH水平的相关性，了解SHH在急性心肌梗死后冠状动脉侧枝循环形成中的作用，为临床上急性心肌梗死治疗提供新的治疗手段。 方法：原代培养SD雄性大鼠心脏微血管内皮细胞（Cardiac microvascular endothelial cells,CMECs），建立氧糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模拟体外缺血再灌注损伤模型，给予外源性重组人SHH蛋白、Cyclopamine处理，RT-PCR检测对照组和OGD组中SHH的mRNA水平；用MTT和Annexin-V-FITC/PI双标记流式细胞术分别检测细胞活力和细胞凋亡；应用ELISA和RT-PCR方法分别检测血管新生因子(VEGF, FGF, Ang-1)的血清水平和 mRNA表达水平；应用RT-PCR和 Western blotting方法分别检测 Sonic hedgehog(SHH)信号通路靶分子(SHH,SMO,Patched-1,Gli-1, Gli-2)的mRNA和蛋白表达水平。 在临床试验中，选择2014年12月-2016年6月于济宁市第一人民医院心血管诊疗中心收治的行急诊PCI术的急性心肌梗死患者298例为研究对象，釆用盲法进行 Rentrop评分，分为无侧枝循环组，侧支循环较差组和侧性循环较好组3组。并且采集患者年龄、性别等基本临床资料以及实验室检查的结果，确定心肌梗死相关动脉，并记录梗死发病的时间。留取患者的术前血浆标本，并采用ELISA法测定血浆SHH水平。釆用SPSS20.0软件进行统计学分析，从而探讨急性心肌梗死患者冠状动脉侧枝循环建立与血浆SHH水平的相关性。 结果：1.与正常对照组相比，OGD组SHH的mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），上述结果表明氧糖剥夺/复氧 CMECs缺血再灌注损伤可以激活SHH信号通路，促使SHH mRNA表达水平升高。 2.与正常对照组相比，加入外源性重组人SHH蛋白后，正常氧糖条件下CMECs的细胞活力显著增加，但其影响可以被抑制剂Cyclopamine显著消减（P＜0.05），上述结果表明SHH可以促进正常氧糖条件下CMECs的细胞活力增强。相反，当细胞在OGD/R条件下，细胞活力与正常对照组相比显著减弱（P＜0.05），表明氧糖剥夺/复氧会导致细胞活力受到抑制；而在SHH处理后与OGD组相比细胞活力显著增加（P＜0.05）；但其影响也可以被抑制剂Cyclopamine显著消减（P＜0.05），上述结果表明SHH可以促进氧糖剥夺/复氧CMECs的细胞活力增强。 3.与正常对照组相比，加入外源性重组人SHH蛋白后，正常氧糖条件下CMECs的细胞凋亡仅稍减少（4.09%），差异无统计学意义（P＞0.05）；当给予抑制剂Cyclopamine处理后CMECs的细胞凋亡较正常对照组相比仅稍增加（6.43%），差异无统计学意义（P＞0.05）。在OGD/R条件下，CMECs细胞凋亡较正常对照组增加（12.4%），差异有统计学意义（P＜0.05），表明OGD/R导致了CMECs的细胞凋亡显著增加；当我们给予激活剂SHH蛋白处理后CMECs的细胞凋亡出现显著减少（5.23%），差异有统计学意义（P＜0.05）；给予抑制剂Cyclopamine处理后发现CMECs细胞凋亡与OGD组相比显著增加（16.7%），差异有统计学意义（P＜0.01），上述结果表明SHH可以抑制氧糖剥夺/复氧CMECs的细胞凋亡。 4.与正常对照组相比，加入外源性重组人SHH蛋白后，正常氧糖条件下血管新生因子VEGF, FGF和 Ang-1的血清水平和mRNA表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），但是SHH的生物学效应可以被SHH信号通路特异性抑制剂Cyclopamine所抑制（P＜0.01），上述结果表明SHH可以促进正常氧糖条件下CMECs的血管新生。在OGD/R条件下，血管新生因子VEGF, FGF和 Ang-1的血清水平和mRNA表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01），同样SHH的生物学效应可以被SHH信号通路特异性抑制剂Cyclopamine所抑制（P＜0.01），上述结果表明SHH可以促进氧糖剥夺/复氧CMECs的血管新生。 5.加入外源性重组人SHH蛋白后，在OGD/R条件下，SHH信号通路中靶分子SHH,SMO,Patched-1,Gli-1和Gli-2的mRNA表达水平明显升高，与OGD组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），但是SHH的生物学效应可以被SHH信号通路特异性抑制剂Cyclopamine所抑制（P＜0.01）。同样，在OGD/R条件下，SHH信号通路中靶分子SHH,SMO,Patched-1,Gli-1和Gli-2的蛋白表达水平明显升高，与OGD组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），但SHH的生物学效应也可以被SHH信号通路特异性抑制剂Cyclopamine所抑制（P＜0.01）。以上结果表明重组人SHH蛋白在激活SHH信号通路的下游信号蛋白表达过程中扮演重要的角色。 6.急性心肌梗死患者冠脉侧枝循环较差组血浆SHH水平与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；并且冠脉侧枝循环较好组中血浆SHH水平显著高于冠脉侧枝循环较差组以及对照组(P＜0.01)，提示在急性心肌梗死患者冠脉侧枝循环评分较高的患者中其血浆SHH含量也比较高(P＜0.01)，并且其相关性独立于年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病家族史、心肌梗死类型、吸烟史、饮酒史、空腹血糖水平、血肌酐、血尿素氮、总胆固醇、甘油三酯、HDL-C、BNP等危险因素单独存在。 结论：1.SHH对缺血再灌注损伤的心脏微血管内皮细胞具有保护作用；CMECs缺血再灌注损伤存在着SHH信号通路的激活；外源性加入重组人SHH蛋白可以增强细胞活力，减轻细胞凋亡，上调血管新生因子VEGF, FGF和 Ang-1的表达，促进新生血管形成，提示SHH信号通路激活在CMECs缺血再灌注损伤后血管再生过程中发挥着举足轻重的作用，可能成为心肌缺血再灌注损伤的潜在治疗靶点。 2.急性心肌梗死患者冠状动脉侧支循环建立与血浆SHH水平明显相关，且血浆SHH水平独立于年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病家族史、心肌梗死类型、吸烟史、饮酒史、空腹血糖水平、血肌酐、血尿素氮、总胆固醇、甘油三酯、HDL-C、BNP等危险因素作用于急性心肌梗死患者缺血心肌区域侧枝循环的形成过程。提示可以将 SHH血清水平作为急性心肌梗死患者冠状动脉侧枝循环形成状况好坏的预测因子。 收起