摘要: 目的：本研究旨在探寻小鼠急性心肌梗死（AMI）后心室重塑早期蛋白质组学的变化，从蛋白质组层面研究心肌梗死后参与心室重塑的分子事件，为心肌梗死后早期心肌保护提供新的思路：1）采用相对和绝对定量的等量异位标签（iTRAQ）技术，高通量、高效率地... 展开 目的：本研究旨在探寻小鼠急性心肌梗死（AMI）后心室重塑早期蛋白质组学的变化，从蛋白质组层面研究心肌梗死后参与心室重塑的分子事件，为心肌梗死后早期心肌保护提供新的思路：1）采用相对和绝对定量的等量异位标签（iTRAQ）技术，高通量、高效率地鉴定及筛选小鼠AMI后差异蛋白的表达；2）在动物模型水平，采用分子生物学手段进行候选靶蛋白的表达验证；3）在细胞模型水平，应用基因转染技术进行靶蛋白的功能验证，探讨靶蛋白的分子生物学作用。 方法：1）将雄性实验小鼠随机分为4组，分别为假手术-3天组（Sham-3d）、假手术-7天组（Sham-7d）、心肌梗死-3天组（MI-3d）以及心肌梗死-7天组（MI-7d）组。采用结扎小鼠左冠状动脉的方法建立AMI模型。建模后通过超声心动图、血流动力学以及病理组织学检测方法评估小鼠AMI后心功能及心室重塑情况。提取蛋白质，采用iTRAQ技术进行AMI后3天和7天差异蛋白质的鉴定及筛选，并通过生物信息学分析，对差异表达蛋白的生物学功能进行初步分析；2）在动物组织水平，采用病理组织学检测，评价AMI后早期心肌纤维化导致心室重塑的情况，并进一步采用qRT-PCR及Western Blot方法对小鼠心肌组织进行靶蛋白的表达验证，选择需要进一步功能验证的靶蛋白；3）在细胞水平，建立缺氧/复氧心肌细胞损伤模型，观察维生素D结合蛋白（VDBP）在心肌细胞损伤0h，6h，12h，24h，48h以及72h的表达变化。进一步构建质粒瞬时转染H9C2心肌细胞以过表达VDBP，并采用MTS法、Tunel法及Annexin V/PI法检测细胞凋亡与坏死，采用qRT-PCR及Western Blot方法检测VDBP相关因子的mRNA转录水平及蛋白表达水平变化，探讨VDBP在心肌损伤早期的分子作用。 结果：1）成功建立小鼠AMI模型，MI-3d组、MI-7d组心肌梗死面积分别为45.29±7.52%、44.83±7.36%，MI-3d组与MI-7d组左心室重量/胫骨长度均较Sham组增高（P＜0.001）；MI-7d组肺脏重量/胫骨长度较Sham-7d组增高（P＜0.001）。超声心动图检测显示，与Sham-3d组相比， MI-3d组左心室内径及舒张期外径显著增大（P＜0.01），左心室前壁及后壁厚度变薄（P＜0.001），左室短轴缩短率显著下降（P＜0.001）；与Sham-7d组相比，MI-7d组左心室内径及舒张期外径显著增大，左心室前壁及后壁厚度变薄，左室短轴缩短率显著下降（P＜0.001）。血流动力学测定显示，与Sham-3d组相比，MI-3d组收缩压、平均主动脉压、左心室压及左心室压力变化速率下降（P＜0.05）；与Sham-7d组相比， MI-7d组收缩压、左心室舒张末压及左心室压力变化速率下降下降（P＜0.01）。HE染色显示，MI-3d组可见大量心肌细胞坏死，可见炎性细胞浸润；MI-7组可见梗死区出现肉芽组织增生，心肌纤维化表现。采用iTRAQ蛋白质组学技术总共鉴定了2540个蛋白，筛选了AMI后表达显著变化的776个差异蛋白。通过对差异蛋白的聚类分析、GO富集及KEGG通路分析，发现wnt、内质网应激（ERS）、维生素D结合蛋白（VDBP）以及肌动蛋白（actin）相关信号通路可能参与AMI后心室重塑的分子生物学过程，其中VDBP可能参与其余3条信号通路的分子生物过程，可能在AMI后心室重塑分子机制中发挥重要作用；2）采用Masson染色发现AMI后心肌胶原含量增加，进一步行免疫组化染色检测I型和III型胶原含量，发现两种类型的胶原在AMI后均增高（P＜0.01）。通过qRT-PCR检测AMI后心肌损伤因子，与Sham组相比，MI组LDH、cTNT、BNP的mRNA转录水平上调（P＜0.05）。对靶蛋白信号通路中的关键因子进行qRT-PCR检测，发现在AMI后3天、7天wnt、ERS、VDBP以及actin相关信号通路活化。采用Western blot检测MI组建模后心梗区和Sham组小鼠左心室组织，结果可见VDBP，维生素D受体（VDR）和凝溶胶蛋白（GSN）的蛋白表达水平较假手术组明显上调（P＜0.001），证实VDBP在AMI后出现蛋白表达的差异性变化；3）成功构建缺氧/复氧H9C2心肌细胞损伤模型，发现VDBP在缺氧/复氧处理后6h、12h的H9C2中表达上调（P＜0.001）。构建过表达VDBP质粒及对照质粒，并采用脂质体介导的方法瞬时转染H9C2，采用qRT-PCR及Western Blot方法检测VDBP的表达显示，过表达VDBP转染H9C2后，VDBP的mRNA转录水平及蛋白表达水平明显上调（P＜0.001）。过表达VDBP组经缺氧/复氧6h处理后，细胞凋亡和坏死增加（P＜0.001）。过表达VDBP处理组的VDR的转录水平及蛋白表达水平明显下调（P＜0.01），GSN，Caspase3的转录水平及蛋白表达水平上调（P＜0.001）。 结论：1）本研究采用iTRAQ蛋白质组学技术高通量鉴定差异蛋白并筛选，通过分子生物学技术验证，发现wnt、ERS、VDBP以及actin相关信号通路参与AMI后心室重塑的分子生物学过程；2）采用过表达VDBP转染H9C2心肌细胞的方法，在缺氧/复氧心肌细胞损伤模型中进行功能验证，证明VDBP加重心肌细胞损伤的作用，并发现过表达VDBP后抑制VDR、上调GSN活性的分子现象；3）在缺氧/复氧心肌细胞损伤模型中，过表达VDBP后caspase3的蛋白表达水平上调，证明VDBP可能通过caspase3介导的细胞凋亡参与AMI后早期心肌细胞损伤的病理生理机制，为靶向干预AMI后心室重塑提供了新的思路。 收起