摘要: 背景和目的： 目前，人类预期寿命延长，老龄化进展提速，再加上人们生活水平提高后膳食组成结构的改变和体育锻炼的缺乏，使得缺血性脑血管病的发病率和患病率逐年增高，严重危害人们身心健康，因此研究和防治脑缺血已成为目前紧要任务。脑缺血区... 展开 背景和目的： 目前，人类预期寿命延长，老龄化进展提速，再加上人们生活水平提高后膳食组成结构的改变和体育锻炼的缺乏，使得缺血性脑血管病的发病率和患病率逐年增高，严重危害人们身心健康，因此研究和防治脑缺血已成为目前紧要任务。脑缺血区分缺血中心区及其周围的缺血半暗带区域，而缺血半暗带区内神经元的损伤具有可逆性，因此促进该区神经元的可塑性有利于损伤后神经元的修复，由于脑内神经细胞的存活及功能状态与细胞骨架蛋白的动态变化有着密切关系，且细胞骨架蛋白可促进神经元的生长发育及其可塑性，因此研究如何增加细胞骨架蛋白在神经修复中的作用，改善患者预后，具有重要的意义。 Sonic Hedgehog(Shh)信号转导通路是hedgehog信号转导途径的主要的信号通路之一，近年研究发现Shh信号通路与细胞骨架蛋白重塑有密切关系。Shh信号通路的激活可促进细胞骨架蛋白表达含量的增加，并增加其稳定性。微管是细胞骨架体系中主要成分之一，α-tubulin是组成微管的重要组成成分。神经系统中，微管蛋白不光是神经细胞发生的标志蛋白，亦是受损神经元结构和功能恢复的关键蛋白。微管结合蛋白-2(MAP-2)也是构成细胞骨架系统的主要成分之一，是神经元中的标志性微管相关蛋白，与神经元的再生、凋亡及可塑性有关。然而目前有关Sonic Hedgehog信号通路对脑卒中的研究在血管再生、氧化应激方面有所涉及，而对细胞骨架蛋白的研究鲜见。 Shh信号通路主要由Shh、Ptch、Smo和Gli蛋白组成，其中Gli-1蛋白是Shh信号通路主要的下游靶基因，Shh不足时，Gli-1表达降低，Shh激活时，Gli-1表达增加，因此Gli-1常常作为检测Shh信号通路激活的标志性分子。Purmorphamine可与Shh信号通路中的Smo蛋白结合，并使Smo蛋白空间构象发生相应改变继而激活Shh信号通路的下游分子，是Shh信号通路的特异性激动剂。本实验采用大鼠急性大脑中动脑脉缺血模型，观察应用purmorphamine激活Shh信号通路后缺血大鼠脑组织神经元内α-tubulin、MAP-2的表达水平变化，以探讨Shh信号通路的激活对永久性脑缺血大鼠细胞骨架蛋白的影响，为缺血性脑血管病的治疗提供新的线索。 材料与方法： 选取健康成年雄性清洁级SD大鼠96只，体重220±30g，采用线栓法制作SD大鼠急性大脑中动脉脑缺血(MCAO)模型。将96只SD大鼠随机分为三组:即假手术组、缺血组、药物干预组，各组再分为1d、3d、7d、14d四个亚组，每个亚组8只大鼠。Purmorphamine在使用之前用二甲基甲酰胺(DMF)溶液使之完全溶解。药物干预组大鼠在模型制作完毕后按0.69mg/Kg的剂量给予purmorphamine溶液腹腔注射，假手术组及缺血组大鼠则在术后给予相应剂量的单纯DMF溶液(0.69mg/Kg)应用相同的方式注射。行使手术后的大鼠清醒后，对其认真观察神经功能缺损状况并进行神经行为学评分，模型成功者于既定时间点将其处死，根据实验要求用相应方法取出脑组织。本实验用免疫组织化学方法测定脑缺血后不同时间点各组大鼠脑组织α-tubulin的表达，用RT-PCR法测定不同时间点各组大鼠MAP-2、Gli-1的表达。 数据分析： 采用SPSS21.0对数据进行统计学处理，实验结果用均数±标准差((x)±s)表示。组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，检验水准取α=0.05。 结果： 1.免疫组化法测定α-tubulin表达情况α-tubulin阳性表达反应主要位于神经元的胞质及胞核中，也可表达于胶质细胞及轴突。假手术组各时间点α-tubulin阳性反应较强，缺血组第1d、3d下降较为明显，随着时间延长，阳性表达逐渐增加，7d、14d表达趋于稳定。药物干预组与缺血组相比，各时间点α-tubulin的表达均明显增多，差异具有统计学意义。 2.用RT-PCR法测定MAP-2表达情况MAP-2的表达主要位于神经元胞体和树突。与假手术组相比，缺血组与药物干预组MAP-2的表达都较低(p＜0.05)。缺血组MAP-2在缺血后表达降低，第1d、3d表达较低，随缺血时间的延长，表达量增加，7d、14d表达增加趋于稳定。给药后，在缺血各时间点的表达与缺血组相比有明显差异(p＜0.05))。 3.用RT-PCR法测定Gli-1表达情况假手术组脑组织内因Shh信号通路未激活，Gli-1的表达水平很低，与假手术组比较，缺血组和药物干预组Gli-1的表达增高，差异具有统计学意义(p＜0.05)。缺血组和药物干预组Gli-1的表达在1d最高，之后有所下降，但表达量仍然较高。药物干预组与缺血组各时间点相比，药物干预组Gli-1的表达明显增高，差异有统计学意义(p＜0.05)。 结论： 1.应用purmorphamine可有效促进Shh信号通路中下游分子Gli-1的表达; 2.激活Shh信号通路可促进缺血后脑组织内α-tubulin、MAP-2表达增加，这可能是其减轻脑缺血后神经损伤的机制之一。 收起