摘要: 目的:研究Shh蛋白对大鼠永久性脑缺血模型的保护作用及其潜在机制。 方法:原代大鼠脑微血管内皮细胞1-2代后,应用糖氧剥夺模拟体外缺血模型,分别给予rHu Shh、Cyclopamine预处理,选取2小时、4小时或6小时三个作用时间点为检测终点,用MTT法或 BrdU染... 展开 目的:研究Shh蛋白对大鼠永久性脑缺血模型的保护作用及其潜在机制。 方法:原代大鼠脑微血管内皮细胞1-2代后,应用糖氧剥夺模拟体外缺血模型,分别给予rHu Shh、Cyclopamine预处理,选取2小时、4小时或6小时三个作用时间点为检测终点,用MTT法或 BrdU染色法检测细胞存活和细胞增殖;建立大鼠永久性脑缺血模型,侧脑室注射rHu Shh或PBS,观察神经行为学评分,应用TTC法检测脑梗塞面积,干湿称重法检测脑水肿,依文思蓝外渗法检测血脑屏障通透性,激光散斑衬比技术检测皮层血流灌注,免疫组织化学法检测缺血梗塞区边缘CD31和α-SMA的阳性表达,用CD31和Ki-67两种抗体进行免疫荧光双标,用共聚焦显微镜观察缺血梗塞区边缘内皮细胞增殖状况。应用实时荧光定量PCR的方法检测Sonic hedgehog(Shh)信号通路中的关键成份(Shh,Patched-1,Gli-1)及血管新生因子(VEGF、Ang-1和Ang-2)的mRNA水平,用免疫印迹法(Western blotting)检测上述因子的蛋白水平。 结果:1)rHu Shh可促进OGD处理下原代培养的脑微血管内皮细胞的存活和增殖能力;2)大鼠永久性脑缺血模型后24小时可见脑组织Shh,Patched-1,Gli-1的mRNA水平和蛋白水平的表达增高,而侧脑室给予rHu Shh可以进一步提高Patched-1的蛋白表达水平;3)侧脑室给予rHu Shh可以显著减轻脑缺血导致的神经功能缺损,降低梗塞面积,减轻脑水肿,改善血脑屏障通透性,提高皮层血流灌注;4)侧脑室给予rHu Shh可以增加缺血梗塞区边缘CD31和α-SMA阳性表达的细胞,增加CD31和Ki-67共定位的阳性细胞;5)侧脑室给予rHu Shh,在大鼠永久性脑缺血模型后24小时的脑组织可见VEGF和Ang-1的mRNA水平和蛋白水平的表达增高。 结论:Shh对缺血损伤的脑微血管内皮细胞具有保护作用;脑缺血后Shh信号通路存在激活;外源性给予Shh可调控血管新生因子的表达,促进血管新生和血管成熟,增加皮层血流灌注,改善血脑屏障通透性,减轻脑梗塞面积和脑水肿程度,进而改善神经功能缺损。提示Shh对缺血性脑损伤具有一定的保护作用,可能成为脑缺血的治疗靶点。 收起