摘要: 人参和三七均为五加科人参属植物，它们都是药用价值极高的传统名贵药材，有很大的医疗价值和经济价值，在我国已有千年的药用历史。人参皂甙(Ginsenosides,GS)是人参的主要活性成分。研究表明，GS在中枢神经系统中具有神经营养和神经保护作用，可以抵... 展开 人参和三七均为五加科人参属植物，它们都是药用价值极高的传统名贵药材，有很大的医疗价值和经济价值，在我国已有千年的药用历史。人参皂甙(Ginsenosides,GS)是人参的主要活性成分。研究表明，GS在中枢神经系统中具有神经营养和神经保护作用，可以抵抗动脉粥样硬化、增强学习记忆、延缓衰老等，因此，分离出有效单体并阐明其作用机制，已成为该领域的研究热点。 人参皂甙Rd(GinsenosideRd,GSRd)是人参皂甙的主要活性成分之一，研究表明GSRd具有抵抗惊厥、延缓衰老、调节免疫等多种药理作用。我们实验室近年研究发现，GSRd可以减轻过氧化氢对PC12细胞的毒性作用，抑制大鼠海马神经元氧糖剥夺损伤；临床试验结果表明，GSRd对急性缺血性脑卒中患者有一定的治疗效果。这些研究结果表明GSRd具有明显的神经保护作用，但是其作用机制目前并不清楚。近年国内学者首先研究报道，GSRd可以明显抑制血管平滑肌细胞上的受体调控性钙通道介导的钙离子内流，而对电压依赖性钙电流的作用不明显；进一步在体实验发现，GSRd能够逆转有卒中倾向的肾血管高压大鼠基底动脉血管肥大再塑形的变化，而这一作用可能与其阻断非电压依赖性钙通道有关。提示GSRd可能是一种潜在的钙离子通道阻断剂。 谷氨酸是中枢神经系统最重要的兴奋性神经递质，对于维持细胞的正常生理活动必不可少。然而，在脑缺血、颅脑外伤、癫痫等多种病理情况下，谷氨酸过度释放激活其受体，导致细胞内钙超载，产生兴奋性毒性作用，是造成神经元损伤的重要因素。其离子型受体是一类重要的配体门控性离子通道。此外，神经细胞上还存在不同类型的电压依赖性钙通道。那么，在中枢神经系统中，GSRd是否会通过影响各种类型钙通道从而发挥神经保护作用，目前尚不清楚。本实验由观察人参皂甙Rd对谷氨酸兴奋性毒性损伤的干预作用入手，逐步深入研究GSRd与不同钙离子通道的关系，初步探讨GSRd神经保护作用的机制。 实验一、人参皂甙Rd对谷氨酸兴奋性毒性损伤的干预作用 目的：研究GSRd对大鼠海马神经元谷氨酸兴奋性毒性损伤的干预作用，并观察其对神经元胞内游离钙离子浓度变化的影响。 方法：采用原代方法培养大鼠海马神经元，免疫荧光染色鉴定神经元纯度。体外培养至第10-14天进行实验。选择500μM谷氨酸作用3h建立谷氨酸损伤模型。使用MTT比色试验检测细胞活性；用TUNEL荧光染色和caspase-3免疫荧光染色评定细胞损伤情况。此外，使用激光共聚焦显微镜，观察GSRd对谷氨酸刺激后神经元胞内游离钙离子浓度变化的影响。用钙离子荧光探针Fluo-4,AM标记细胞内游离钙，以Fluo-4的荧光强度反映细胞内游离钙离子浓度变化。 结果：MTT检测结果显示，谷氨酸损伤组细胞出现显著损伤，神经元活性降至50%左右，而GSRd干预组神经元活性则有明显提高，以1和10μMGSRd作用最明显，与谷氨酸损伤组间差别显著。TUNEL染色结果显示，GSRd干预组神经元凋亡数量较谷氨酸损伤组明显减少；caspase-3免疫荧光染色结果与TUNEL染色结果表现一致。神经元胞内游离钙离子浓度变化检测结果表明，在给予高浓度谷氨酸刺激后，荧光强度迅速明显升高，而加入GSRd干预，则使荧光强度升高的幅度明显降低，并且GSRd的作用具有剂量相关性，在0.1-10μM之间作用明显。 结论：GSRd可以增强海马神经元对谷氨酸兴奋毒性损伤的抵抗作用，并且这一作用与其减轻谷氨酸诱导的细胞内钙超载有关。 实验二、人参皂甙Rd对不同类型钙通道的影响 目的：观察GSRd对谷氨酸离子型受体主要是NMDA受体、胞内钙库释放以及电压依赖性钙通道的影响，研究GSRd影响细胞内钙离子浓度的可能机制。 方法：原代方法培养大鼠海马神经元，免疫荧光染色鉴定神经元纯度。体外培养至第10-14天进行实验。使用钙离子荧光探针Fluo-4,AM标记细胞内游离钙，以Fluo-4的荧光强度反映细胞内游离钙浓度变化。应用激光共聚焦显微镜，分别观察GSRd对NMDA和KCl刺激后神经元胞内游离钙离子浓度变化的影响。将细胞外液更换为无钙液，给予谷氨酸刺激观察GSRd对胞内钙库释放的影响。 结果：给予高浓度NMDA刺激后，神经元胞内的荧光强度逐渐升高；而加入GSRd干预，发现荧光强度也有轻度的增强，但较前者不甚明显。更换无钙液后给予高浓度谷氨酸刺激，神经元胞内标记游离钙的Fluo-4荧光强度明显变亮，然而又很快变暗，显示出短暂快速的胞内钙释放过程；而GSRd干预组中，给药后荧光强度也出现同样的快速变化过程，但变化的幅度较谷氨酸损伤组有所降低。50mMKCl刺激引起细胞内钙离子荧光强度迅速升高，而GSRd干预组，胞内荧光强度升高的峰值与单纯KCl刺激组没有差别，但荧光强度随作用时间延长而逐渐降低，逐渐出现显著差别。 结论：GSRd能够抑制NMDA受体介导的钙内流，同时，人参皂甙Rd对谷氨酸诱导的胞内钙库释放也有一定的抑制作用。提示GSRd可能通过抑制NMDA受体及胞内钙库释放作用，减轻细胞内钙超载，这可能是GSRd神经保护作用的机制之一。 收起