摘要: 目的： 1.观察吡咯喹啉醌（PQQ）对体外培养海马神经元谷氨酸损伤的保护作用，并初步探讨其作用机制。 2.观察 PQQ对谷氨酸脑内注射大鼠模型神经元损伤的保护作用，并分析其作用机制。 方法： 1.体外培养胚胎大鼠海马神经元，神经元特异性... 展开 目的： 1.观察吡咯喹啉醌（PQQ）对体外培养海马神经元谷氨酸损伤的保护作用，并初步探讨其作用机制。 2.观察 PQQ对谷氨酸脑内注射大鼠模型神经元损伤的保护作用，并分析其作用机制。 方法： 1.体外培养胚胎大鼠海马神经元，神经元特异性染色（MAP2）鉴定神经元纯度；通过CCK-8法检测不同浓度PQQ（12.5μM、25μM、50μM、100μM）对正常培养海马神经元细胞活力的影响。 2.建立原代培养的海马神经元谷氨酸急性损伤模型（125μM，15 min），通过细胞形态观察和CCK-8法，观察PQQ对谷氨酸损伤海马神经元形态和细胞活力的影响。 3.通过Hoechst33342和TUNEL染色，观察PQQ对谷氨酸损伤海马神经元凋亡的影响。 4.通过Western blot和Caspase-3酶活性检测，观察PQQ对谷氨酸损伤海马神经元凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白表达及凋亡相关蛋白酶Caspase-3活性的影响。 5.钙离子荧光探针Fluo-4/AM标记海马神经元，激光共聚焦显微镜下检测PQQ对谷氨酸诱导的Ca2+内流的影响。 6.通过TMRM染色，检测PQQ对谷氨酸诱导的海马神经元线粒体膜电位改变的影响。 7.通过活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）分析，观察 PQQ对谷氨酸损伤神经元氧自由基生成及清除的影响。 8.通过线粒体氧化呼吸链不同复合物的抑制剂应用，寻找PQQ在线粒体自由基清除中可能的作用靶点。 9.通过Western blot检测Akt、GSK3β、JNK和P38蛋白磷酸化水平的表达变化，并加入相应通路抑制剂，观察各抑制剂对PQQ保护功能的影响，寻找PQQ保护作用相关的信号转导途径。 10.通过免疫荧光化学观察PQQ对谷氨酸损伤海马神经元Nrf2表达定位的影响，实时定量PCR检测PQQ对转录因子和抗氧化基因（Nrf1、Nrf2、HO-1、GCLC）的表达影响，并观察PI3K抑制剂的影响作用。 11.构建谷氨酸脑内注射模型，TUNEL检测PQQ在体内对大脑皮层神经细胞凋亡的影响，FCM分析PQQ对谷氨酸脑内注射大鼠皮层细胞ROS生成的影响，并检测SOD、GSH和MDA活性及含量的变化。 12.通过实时定量PCR和Western blot检测PQQ对谷氨酸脑内注射大鼠皮层细胞转录因子和抗氧化基因（Nrf1、Nrf2、HO-1、GCLC）表达及磷酸化 GSK3β表达的影响。 结果： 1.原代培养的海马神经元纯度较高，达95%以上，0~100μM浓度范围内PQQ对正常培养的神经元细胞活力没有显著影响。 2. PQQ对谷氨酸损伤的海马神经元具有保护作用，能抑制细胞活力的下降和减少细胞凋亡的产生，并呈现剂量依赖效应，在浓度为100μM时作用最佳。 3. PQQ能调节谷氨酸损伤海马神经元中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的比例，降低凋亡蛋白酶Caspase-3的活性。 4. PQQ能稳定线粒体膜电位，减少谷氨酸诱导的Ca2+内流。 5. PQQ通过抑制谷氨酸损伤神经元中ROS的生成及增加ROS的清除，减少氧化应激损伤。 6.线粒体复合物I、III和IV抑制剂能增加海马神经元中ROS的生成，PQQ能减少复合物I和III抑制剂诱导的ROS增加，提示其作用靶点可能位于复合物I和III。 7. PQQ能维持谷氨酸损伤神经元中Akt的持续活化并激活其下游GSK3β信号，同时抑制JNK信号的激活。使用PI3K抑制剂可以阻断PQQ对神经元的保护作用及对凋亡蛋白比例的调节。 8. PQQ能促进Nrf2的核转位和表达，增加下游ARE依赖抗氧化基因HO-1和GCLC的表达，这种作用可以被PI3K抑制剂所抑制。 9. PQQ对谷氨酸脑内注射大鼠具有保护作用，可以减少注射周围皮层细胞凋亡的发生和降低大脑皮层细胞ROS的含量。 10. PQQ能促进谷氨酸脑内注射大鼠大脑皮层内Nrf2、HO-1和GCLC的表达，增加磷酸化GSK3β的表达，这可能与其保护功能相关。 结论：PQQ对体外培养的海马神经元谷氨酸损伤具有保护作用，能调节凋亡相关蛋白的比例及蛋白酶活性从而抑制细胞凋亡的发生。PQQ在体内也能拮抗谷氨酸诱导的大脑皮层细胞凋亡。PQQ的保护作用可能与稳定线粒体功能、减少Ca2+超载、降低 ROS损伤和增加抗氧化基因的表达相关。PI3K/Akt/GSK3β信号途径的活化在PQQ的保护功能中可能发挥了关键作用。 收起