摘要: 本研究分为二部分： 第一部分：α、β、γ-晶体蛋白在哺乳类动物角膜中的表达 目的:角膜是如何维持其透明性的机制仍不清楚。角膜晶体蛋白(酶类晶体蛋白)在脊椎或无脊椎动物角膜中表达并在角膜的透明性中起重要作用。本实验重点研究3种经典晶状体... 展开 本研究分为二部分： 第一部分：α、β、γ-晶体蛋白在哺乳类动物角膜中的表达 目的:角膜是如何维持其透明性的机制仍不清楚。角膜晶体蛋白(酶类晶体蛋白)在脊椎或无脊椎动物角膜中表达并在角膜的透明性中起重要作用。本实验重点研究3种经典晶状体晶体蛋白(非酶类晶体蛋白)，即α、β、γ-晶体蛋白，是否参与小鼠和人类角膜的透明性。 方法：利用Balb/c和C57BL/6小鼠，分别用缝线和化学烧伤诱导角膜新生血管模型，应用基因芯片和实时荧光定量PCR(RT-Q-PCR)技术检测相关基因的表达变化;在角膜或培养的角膜细胞中，应用RT-Q-PCR检测晶状体晶体蛋白和角膜晶体蛋白的mRNA表达水平，应用免疫组化(IHC)或蛋白质印迹法检测他们的蛋白表达水平。 结果：通过基因芯片或RT-Q-PCR技术检测到晶体蛋白基因在角膜或培养的角膜细胞中丰富表达，也可以通过IHC或蛋白质印迹法检测到α、β、γ-晶体蛋白在角膜或培养的角膜细胞中表达。在缝线和化学烧伤诱导的新生血管模型中，晶状体晶体蛋白基因表达表现出时间和种属的依赖性改变模式，且与角膜晶体蛋白的改变不同。外源性氧化或炎性刺激如H2O2和脂多糖能影响角膜细胞中晶状体晶体蛋白的表达。 结论：α、β、γ-晶体蛋白在维持哺乳动物角膜透明性起重要作用。相关机制的进一步研究将有助于揭开角膜透明性的奥秘。 第二部分：小鼠角膜病变模型研究中实时荧光定量PCR最佳内参基因的筛选 目的:在几种常用的小鼠角膜病变模型中，为实时荧光定量PCR(RT-Q-PCR)筛选稳定表达的内参基因。 方法：利用Balb/c和C57BL/6小鼠建立本实验室常用的角膜病变模型，1)、角膜新生血管模型(CorNV)，分别采用缝线和化学烧伤诱导的角膜新生血管模型;2)、真菌角膜炎模型，分别采用白色念珠菌和烟曲霉菌诱导的真菌角膜炎模型;3)、角膜贯通伤诱导的角膜创伤模型。应用基因芯片和RT-Q-PCR检测8个常用内参基因(甘油三磷酸脱氢酶(GAPDH),β-肌动蛋白(ACTB)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、核糖体蛋白L5(RPL5)、泛素C(UBC)、肽基异构酶A(PPIA)、TATA盒结合蛋白(TBP1)和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT1)在每个模型不同时间点的表达变化清况，采用geNorm和NormFinder统计软件分析RT-Q-PCR的结果。 结果：基因芯片结果分析显示，在角膜新生血管状态下，8个内参基因的稳定性依次:PPIA>RPL5>HPRT1>ACTB>UBC>TBP1>GAPDH>LDHA。RT-Q-PCR的结果分析显示:在8个内参基因中，没有一个基因在所有实验条件下是恒定表达的，在大部分实验条件下，GAPDH和ACTB表达最不稳定。NormFinder和geNorm在不同角膜模型中分别推荐最佳单个内参基因和成对内参基因。NormFinder推荐PPIA在CorNV和PCI模型中为最佳内参基因，UBC在真菌角膜炎模型中为最佳内参基因。geNorm分析结果显示，在不同模型或在不同品系小鼠建立同一模型中，其最佳内参基因就不一样。在CorNV in Balb/c和C57BL/6模型中，GeNorm分别推荐PPIA&HRPT1和PPIA&RPL5作为最佳内参基因;白色念珠菌和烟曲霉菌诱导的真菌角膜炎模型中，GeNorm分别推荐UBC&HPRT1和UBC&LDHA作为最佳内参基因。 结论：在进行角膜相关研究，为RT-Q-PCR选取最佳内参基因有利于角膜相关表达基因的研究;在没有最适内参基因的情况下，可选取PPIA,UBC或结合HPRT1、RPL5作为内参基因。 收起