摘要: 目的: 运用差异显示技术结合硝酸银染色筛选大鼠肌肉挫伤后与正常肌肉表达差异的基因，并通过Real—timePCR方法研究差异基因与损伤时间的关系，旨在寻找一种或几种与损伤相关的敏感基因，为法医学损伤时间推断提供科学、有效的指标。 方法: 1. ... 展开 目的: 运用差异显示技术结合硝酸银染色筛选大鼠肌肉挫伤后与正常肌肉表达差异的基因，并通过Real—timePCR方法研究差异基因与损伤时间的关系，旨在寻找一种或几种与损伤相关的敏感基因，为法医学损伤时间推断提供科学、有效的指标。 方法: 1. 12只健康成年SD大鼠随机分为实验组和正常对照组。实验组大鼠建立肌肉挫伤模型，损伤后4小时处死，提取100mg损伤处肌肉组织。对照组大鼠在规定时间内处死，提取相同部位100mg肌肉组织。两组肌肉组织经SV Total RNA Isolation system提取总RNA，并经Agilent 2100 Bioanalyzer进行质量控制检测，SIN值大于8.0的样本经反转录后用于下游实验。 2．采用4种锚定引物和3种随机引物共12种组合对实验组和对照组样本进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后硝酸银染色进行差异表达分析。采用煮沸法回收差异条带，并进行二次扩增，扩增产物纯化后与载体连接、克隆，进行序列分析，将测序所得差异序列与GenBank进行同源性比较。 3.4只健康成年SD大鼠随机分为正常对照组和损伤组，提取各组样本的总RNA。在差异序列两端设计特异性引物，采用SYBR()GreenⅠ染料法进行Real—timePCR扩增，通过分析扩增曲线及溶解曲线，鉴定差异表达基因的真伪。 4.12只健康成年SD大鼠随机分为正常对照组、损伤后6小时组和损伤后12小时组。采用Real—timePCR检测正常肌肉组织、损伤后6小时肌肉组织和损伤后12小时肌肉组织中β—Actin等九种常用内参基因的表达水平，通过Normfinder、geNorm和BestKeeper三种软件分析九种常用内参基因在肌肉组织损伤后表达的稳定性，寻找合适的内参基因。 5.54只健康成年SD大鼠随机分为正常对照组和损伤组，建立不同损伤时间大鼠肌肉挫伤模型，提取总RNA、反转录后采用差异基因的上下游特异性引物进行Real—timePCR扩增，分析差异基因与损伤时间的关系。 结果: 1．采用Progema公司的SV Total RNA Isolation System提取的总RNA具有较高的RIN值，且没有DNA及蛋白质的污染。各样本RIN值在8.3～8.8之间，均大于8.0。每个样本都可见清晰的18s及28s峰，在18s峰之前基线平坦，没有降解的RNA片段出现。28s峰之后，基线也比较平直，说明没有基因组DNA及蛋白质的污染，可以保证后续验证实验的准确性。 2．经过对21条感兴趣的差异条带进行回收及再扩增，共有12条差异条带得到成功回收。DNA重组、转化及蓝白斑筛选重组成功的载体，经序列分析有5条差异条带片段较长，其他条带片段较短，多数为引物二聚体序列。 3．经过与GenBank进行同源性比较及Real—timePRC鉴定，5条差异性片段均从总RNA中得到了有效扩增，且溶解曲线均为单一峰型，说明均为阳性差异片段。其中3条为已知基因，与sTnI、Mx2及Cox6c匹配度较高，另外两条可能为新基因，有待于进一步研究。 4．通过Real—timePCR的方法测定损伤后不同时间点肌肉组织中常用内参基因的CT值，经geNorm、Normfinder及BestKeeper软件分析，得出RPL13和RPL32在肌肉组织损伤后表达相对稳定，可以作为内参基因对目的基因进行均一化处理。而常用的β—Actin及GAPDH在不同损伤时间肌肉组织中表达不稳定。 5、经Real—timePCR分析，sTnI mRNA在损伤后表达逐渐降低，在0.5h、1h、6h sTnImRNA表达量分别为正常组的78.17％、41.58％、32.13％，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，6h～36h sTnI mRNA表达量与对照组相比无统计学差异(P＞0.05)。Mx2 mRNA在损伤后0.5小时表达骤然升高达到正常对照组的84.3倍，随着损伤时间的延长，其表达量逐渐下降，损伤后18小时降低到正常对照组的0.65倍，在损伤后24小时又出现一个表达高峰，达正常对照组的37.1倍，随后又逐渐下降。Frag-3 mRNA在损伤早期随着时间延长表达量逐渐增高，损伤后6小时其表达量高达正常对照组的243.5倍，损伤后12小时恢复到接近正常表达量水平，损伤后18小时，又出现一个小的表达高峰，为正常对照组的11.38倍，随后又下降至正常组水平。肌肉挫伤后Cox6c mRNA表达量的变化幅度较小，在正常组表达量的0.24～1.57倍之间。损伤后0.5小时，Cox6c mRNA表达量最高，为正常对照组的1.57倍。随着损伤时间的延长，其表达量逐渐减少，在1小时和6小时分别为正常对照组的1.29倍和1.19倍。损伤后18小时，其表达量已降至正常组水平以下，30小时表达量最低，为正常对照组的0.24倍。Frag-5 mRNA在肌肉损伤后36小时内均呈现相对高表达的状态。损伤的初始阶段其表达量迅速升高，0.5小时达到正常对照组的5.7倍，1小时达到一个高峰，为正常对照组的6.19倍。随后开始下降，12小时达到最低表达量，为正常对照组的1.2倍。在18小时达到又一个高峰，为正常对照组的8.6倍。 结论: 通过DDRT-PCR技术共发现5条差异性片段，其中三条与sTnI、Mx2及Cox6c的基因序列匹配度较高，另外两条可能为新基因。经实时荧光定量分析，sTnI、Cox6c mRNA相对表达量与损伤时间有关，随肌肉挫伤后时间的延长呈现规律性变化，且其变化幅度较小，速度较平稳，可以考虑作为损伤时间推断的标记。 收起