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1. 阿司匹林对多发性骨髓瘤的抗肿瘤效应及其增强硼替佐米细胞毒作用的分子机制研究

[学位论文] 丁江华南昌大学医学院 2014年博士导师: 陈国安共163页

摘要 : 背景与目的: 近年来,世界范围内人口的迅速老龄化,使得多发性骨髓瘤( Multiple Myeloma, MM)的发病率明显升高,位居血液肿瘤第2位,仅次于非何杰金淋巴瘤。尽管免疫调节剂与蛋白酶体抑制剂为代表的药物极大地改善了MM预后,但是几乎所有的MM患者最... 展开背景与目的: 近年来,世界范围内人口的迅速老龄化,使得多发性骨髓瘤( Multiple Myeloma, MM)的发病率明显升高,位居血液肿瘤第2位,仅次于非何杰金淋巴瘤。尽管免疫调节剂与蛋白酶体抑制剂为代表的药物极大地改善了MM预后,但是几乎所有的MM患者最终出现疾病难治与复发,至今仍属不可治愈性疾病。作为核心药物的硼替佐米(Bortezomib,BTZ),已被广泛用于诱导、巩固、挽救与维持治疗等阶段。然而,BTZ的持续应用导致继发性耐药发生。近年来发现阿司匹林(Aspirin,ASA)在人结肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中具有抗癌与肿瘤预防作用。本研究旨在通过观察ASA在体外实验与荷MM小鼠体内是否具有抗癌作用,并探讨ASA抗骨髓瘤效应的作用机制,进一步分析ASA与BTZ在MM细胞系中相互作用及分子机制,为ASA临床应用治疗MM及增强BTZ疗效提供理论与实验依据。方法: 1、采用CCK-8与PI染色方法,分别检测不同浓度ASA(0、2.5、5.0、10.0mmol/L)对地塞米松敏感与耐药MM细胞系(MM1.S与RPMI-8226)的细胞增殖活性与细胞周期的影响,观察ASA对MM细胞的抗癌效应。 2、采用Annexin V-FITC/PI染色法、比色法与Western blot方法,分别检测ASA对MM细胞系凋亡率、Caspase-3、-8、-9活性与PARP蛋白表达的影响,分析ASA对MM细胞的促凋亡作用。 3、采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测ASA对MM细胞系Bcl-2、Bax与VEGF的mRNA与蛋白表达的影响,探讨ASA在MM细胞中的抗癌机制。 4、通过建立人MM细胞移植瘤NOD/SCID小鼠动物模型,观察ASA对荷瘤小鼠生存期与移植瘤生长的影响,探讨ASA在体内的抗骨髓瘤作用。 5、采用CCK-8方法与Annexin V-FITC/PI染色方法,通过检测ASA(2.5mmol/L)联合BTZ(10nmol/L)对MM1.S与RPMI-8226的细胞增殖活性与细胞凋亡的影响,分析ASA与BTZ在MM细胞中的药物相互作用。 6、采用Western blot方法,检测ASA、BTZ、ASA联合BTZ分别处理MM细胞系后Akt磷酸化与Survivin蛋白水平,探讨ASA对BTZ抗骨髓瘤作用的增敏机制。结果: 1、ASA对MM1.S细胞与RPMI-8226细胞均有显著的增殖抑制作用,这种作用在2.5~10mmol/L范围内呈剂量依赖性。在24~72h内,ASA对MM1.S细胞与RPMI-8226细胞的增殖抑制率呈时间依赖性。 2、在2.5~10mmol/L范围内,ASA以剂量依赖性诱导MM1.S与RPMI-8226细胞凋亡。2.5~5mmol/L ASA对MM1.S细胞的凋亡诱导率高于RPMI-8226细胞,但10mmol/L ASA对两种细胞的凋亡诱导率相同。 3、ASA处理MM1.S与RPMI-8226细胞后,G1期细胞比例均呈剂量依赖性增高,而S期细胞比率相应地降低。 4、ASA处理MM1.S与RPMI-8226细胞后,Caspase-3活性均以浓度依赖性升高,同时伴随Caspase-8与Caspase-9活性的明显升高。 5、在2.5~10mmol/L范围内,ASA促进MM1.S与RPMI-8226细胞的PARP蛋白(116KD)裂解,且呈剂量依赖性。 6、在MM1.S细胞与RPMI-8226细胞中,ASA以浓度依赖性下调Bcl-2与VEGF mRNA与蛋白表达,而Bax mRNA与蛋白则呈浓度依赖性上调。 7、通过对NOD/SCID小鼠分别皮下接种MM1.S与RPMI-8226细胞(1×107个/只),成功地建立了荷骨髓瘤移植瘤小鼠动物模型,瑞氏染色与H-E染色显示为典型的骨髓瘤细胞,总成瘤率为71.88%(23/32)。 8、与PBS对照组相比,ASA处理明显抑制了荷MM细胞系(MM1.S细胞与RPMI-8226细胞)移植瘤小鼠的肿瘤生长。 9、与PBS对照组相比,ASA处理显著延长了荷MM细胞系(MM1.S细胞与RPMI-8226细胞)移植瘤小鼠的中位生存期(37.5dvs21d,p=0.035;35.5d vs21d,p=0.035)。 10、ASA与BTZ联合组以时间依赖性抑制MM1.S与RPMI-8226细胞的增殖活性,且明显高于ASA或BTZ单药组。进一步分析ASA与BTZ的相互作用,发现二者在抑制MM细胞增殖中呈相加作用。 11、在MM1.S与RPMI-8226细胞中,ASA与BTZ联合组的细胞凋亡率均明显高于ASA单药组及BTZ单药组。 12、ASA单药可抑制MM细胞Akt-Thr308磷酸化;而BTZ单药诱导MM细胞Akt-Thr308磷酸化。但ASA与BTZ联合组则几乎完全抑制MM细胞Akt-Thr308磷酸化。 13、ASA单药与BTZ单药抑制MM细胞的Akt-Ser473磷酸化。然而,与ASA或BTZ单药相比,ASA与BTZ联合组显著抑制Akt-Ser473磷酸化。 14、ASA单药下调MM细胞Survivin蛋白水平;而BTZ单药则上调MM细胞Survivin表达。ASA与BTZ联合组较ASA单药更显著抑制MM细胞Survivin蛋白水平。结论: 1、ASA在体内外均具有抑制MM细胞增殖的作用。 2、ASA通过线粒体与死亡受体两条途径诱导MM细胞凋亡。 3、ASA的抗MM作用不依赖于地塞米松的敏感性。 4、ASA诱导骨髓瘤细胞周期阻滞于G1期。 5、ASA通过下调MM细胞Bcl-2与VEGF及上调Bax表达而起抗癌作用。 6、ASA对硼替佐米的抗骨髓瘤效应具有增强作用。 7、ASA通过抑制硼替佐米诱导的Akt磷酸化发挥化疗增敏作用。 8、ASA通过下调Survivin蛋白发挥对硼替佐米的抗骨髓瘤作用。收起

关键词 : 阿司匹林硼替佐米多发性骨髓瘤抗癌机制增敏作用

2. 钙通道CACNA1C基因突变致心原性猝死相关早期复极的分子遗传学机制探讨

[学位论文] 刘欣南昌大学医学院 2015年博士导师: 洪葵共162页

摘要 : 心原性猝死（sudden cardiac death, SCD）是人类健康头号杀手心血管疾病导致的突发性自然死亡。在诸多SCD高发的心血管疾病中，具有极高风险尤其对年轻人造成危害的遗传性心律失常综合征日渐受到关注。主要由各种离子通道蛋白及其调控蛋白编码基因突... 展开心原性猝死（sudden cardiac death, SCD）是人类健康头号杀手心血管疾病导致的突发性自然死亡。在诸多SCD高发的心血管疾病中，具有极高风险尤其对年轻人造成危害的遗传性心律失常综合征日渐受到关注。主要由各种离子通道蛋白及其调控蛋白编码基因突变导致的遗传性心律失常综合征通常不伴心脏结构功能异常，而呈现以各种特征性的心电图形态，在特殊环境状态下诱发严重的心电生理活动紊乱促使恶性心律失常发生，从而导致SCD。早期复极（early repolarization, ER）是部分心肌提前复极形成心电图上J点抬高和非心肌缺血性ST段抬高的特殊波形，在人群中广泛存在，且在半个世纪以来被认为是一种正常的心电图表现。随着流行病学调查研究的大力开展，部分有ER表现的人群被发现存在SCD风险及家族聚集现象。如何辨别具有SCD风险的ER表现成为临床医生所面临的棘手问题。在最新的遗传性心律失常综合征诊治共识中，这类具有恶性心律失常病史或SCD家族史且心脏结构正常，≧2个连续下壁和/或侧壁导联出现J点抬高≧1 mm心电图表现的一组临床症候群被定义为早期复极综合征（earl repolarization syndrome, ERS）。近年来分子遗传学理论和技术的飞速发展极大地推动了人们对遗传性心律失常综合征中各类疾病的认知与探索。编码 ATP敏感性钾离子通道 Kir6.1的KCNJ8和 ABCC9基因，编码 L型钙离子通道的 CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因，以及编码钠离子通道的SCN5A基因突变相继在ERS中报道。突变导致的外向钾离子通道功能增强和内向钙离子或钠离子通道功能减弱被认为是ERS的病理性致病基础。ER不同于长QT综合征和Brugada综合征等其它具有显著遗传学特性的遗传性心律失常综合征类型，ERS致病基因突变多见于散发病例，具有家族遗传性的基因突变罕见。此外，国人ERS的遗传学研究报道罕见，由此可见国人相关致病基因突变的研究仍存在很大空间，对有明显症状或猝死家族史的家系进行级联式遗传学筛查才能高效地筛查致病基因突变，并探索ERS分子遗传学发病机制，从而寻找更加有效的ERS个体化治疗方案。第一部分心原性猝死大家系临床分析及遗传学检测目的：本研究通过对所收集的 SCD大家系先证者及存活成员进行全面的临床评估，并对先证者尸检报告仔细分析以及家系成员SCD候选基因筛查检测，解析该家系SCD发生机制，以异常心电图表现为线索寻找潜在的致死性原因及致病基因突变，为该家系SCD高危成员提供诊疗建议。方法： 1.临床资料收集：严格遵循医学伦理准则，经医院伦理委员会审批获准及入选研究对象知情同意，对我院心内科就诊的江西籍SCD高危患者及其亲属临床资料进行采集。诊断标准参考2013年由美国心律协会（Heart Rhythm Society, HRS）、欧洲心律学会（European Heart Rhythm Association, EHRA）和亚太心律协会（Asia Pacific Heart Rhythm Society, APHRS）共同制定的遗传性心律失常综合征患者诊断和治疗专家共识，获取家系成员病史，心电图和心脏彩超等检查信息。 2.尸检资料收集：在SCD死者法定代理人知情同意的情况下，获取死者经司法机构提供的尸检报告及相关病理组织。 3.先证者心肌组织 HE染色：取死者心肌不同部位组织块制作切片并 HE染色，观察心肌组织结构形态。 4.遗传学检测：经患者及其家属知情同意后，采集外周静脉全血5 ml储存于EDTA真空抗凝管，采用血液基因组DNA提取试剂盒抽提外周血白细胞全基因组DNA，选择常见的遗传性心律失常综合征致病基因作为候选基因，包括编码钠离子通道的SCN5A、SCN1B、SCN3B和GPA1L基因，编码钾离子通道的KCNQ1、KCNH2、KCNJ8、KCNE1、KCNE2和 KCND3基因，编码钙离子通道的CACNA1C、CACNB2b和CACNA2D1基因以及编码通道调节蛋白的ANK2和PRKAG2基因，设计相应引物，使所测范围涵盖待测基因所有外显子以及外显子与内含子交界区序列，采用DNA直接测序法（双脱氧链终止法）进行测序筛查基因变异，随机选取本实验室DNA库中400例相同遗传背景及年龄性别匹配的正常健康人群标本作为对照，以发现新的致病基因突变位点或单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）。 5.统计学分析：所有涉及统计的实验数据均采用SPSS19.0软件包统计学分析软件进行分析。计量资料以均数±标准误（-x±s）表示，两组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P值＜0.05具有统计学意义，P值＜0.01具有显著统计学意义。结果： 1.本研究收集到一个原因不明夜间猝死大家系，死者为包含先证者在内的5名男性成员，先后在睡眠中发生猝死，均处青壮年时期，最小23岁，最大49岁，平均年龄34±8.4岁。 2.先证者尸检报告提示无机械性损伤、机械性窒息致死的法医病理学改变，也无中毒致死的依据；组织病理学检查结果排外各主要器官器质性病变，考虑猝死可能由心原性因素所致。所取心肌组织形态结构及排列均正常，可排外心肌病等各种结构性心脏病以及可伴右室心肌病变的Brugada综合征。先证者死前3年内偶发头晕、心悸，无胸闷、胸痛及晕厥；既往心脏彩超检查无明显异常，24小时3导联动态心电图记录II导联和aVF导联J点抬高≧1.5mm。 3.其他家庭成员既往史及个人史无特殊，无阳性体征，静息心电图、心脏彩超及平板运动试验检查未见明显异常。24 h动态心电图检查发现3位家庭成员有ER表现。其中先证者弟弟ER表现最为显著，下壁II、III和aVF导联，胸前V3~V5导联J点抬高0.05 mV~0.3 mV，且可见J波，V2~V4导联T波高尖。先证者儿子及其弟弟女儿的动态心电图表现为下壁和侧壁导联ST段抬高。 4.通过候选基因测序筛查发现该家系1个钙离子通道α1亚单位编码基因CACNA1C的杂合错义突变，由第48号外显子上第5747号碱基A转换为碱基G，导致第1916位谷氨酰胺变为精氨酸，即p.Q1916R。该突变见于先证者及源于父系的所有一级和二级亲属，而其母亲及母亲的兄弟姐妹和其他与先证者无血缘关系的家庭成员均不存在此突变。此外，在家系中还筛查到已被报道的5个CACNA1C基因SNPs，分别为c.2436C>T（p.D812D），c.3786C>T（p.F1262F）， c.5361G>A（p.T1787T），c.5609C>T（p.T1870M）和 c.5649G>A（p.P1883P），以及1个SCN5A基因SNPs，c.3578G>A（p.R1193Q）。 5. CACNA1C-Q1916R突变携带者中有ER表现和无ER表现成员心电图参数比较结果显示，有ER表现成员的心率校正QT间期比无ER表现的成员短，但均在正常范围，QT间期离散度（QT dispersion，QTd）和Tp-Te间期离散度（Tp-Te dispersion，Tp-ed）则更大，但两组间各参数差异无统计学意义。结论： 1.本研究从一个青壮年男性SCD高发大家系，揭示SCD可能与ERS相关。 2. ERS致病基因CACNA1C-Q1916R新突变可能与该家系ERS致SCD相关。 3. CACNA1C-Q1916R突变携带家庭成员中 ER呈不完全外显性，考虑与SCN5A-R1193Q和性别相关。 4. ER家庭成员心电图中有致恶性心律失常性作用的复极化跨壁离散度参数指标QTd和Tp-ed增大，但与无ER表现的CACNA1C突变携带成员比较无统计学差异，样本量有限是可能原因。 5.其它所发现的CACNA1C基因SNPs（D812D、F1262F、T1787T、T1870M和P1883P）无明显致SCD效应。第二部分 CACNA1C基因突变致心原性猝死相关ER的分子遗传学、细胞电生理机制及药物干预探讨目的：从组织和细胞水平探讨CACNA1C-Q1916R突变的功能变化及致SCD相关ER的分子机理，并筛选有效的治疗药物。方法： 1.人心肌组织标本免疫组化：取携带CACNA1C基因突变先证者左心室肌组织，通过免疫组化法对组织内由CACNA1C基因翻译的Cav1.2蛋白表达及定位进行检测，并以成年人正常左心室标本作为对照。 2. CACNA1C-Q1916R定点突变：采用经典的定点突变技术，将CACAN1C基因第5747位碱基A突变为碱基G，进行测序验证并排除其它位点突变。 3. CACNA1C质粒瞬时转染：采用Lipofectamine2000转染试剂盒，将携带野生和突变型CACNA1C，以及野生型CACNB2b和CACNA2D1基因的质粒载体按摩尔浓度1:1:1分两组共转染入人胚肾293细胞（human embryonic kidney293, HEK293）中用于后续实验，用于膜片钳细胞电生理实验的细胞则按0.3比例额外转染表达绿色荧光的pEGFP-N3质粒。 4.实时荧光定量 PCR（ Quantitative Real time PCR, qRT-PCR）：采用qRT-PCR引物扩增表达野生和突变型CACNA1C的HEK293细胞中 CACNA1C的序列片段，检测突变对Cav1.2总mRNA表达的影响。 5.蛋白免疫印迹（Western Blot）：采用Western Blot检测表达野生和突变型CACNA1C的HEK293细胞中，Cav1.2在细胞总蛋白、膜蛋白和浆蛋白各水平的表达情况。 6.细胞免疫荧光：在共聚焦荧光显微镜下观察转染野生和突变型CACNA1C并经Cav1.2特异抗体荧光染色的HEK293细胞，检测突变对Cav1.2表达定位及转运的影响。 7.全细胞膜片钳细胞电生理分析及药物筛选：采用全细胞膜片钳技术记录表达突变型CACNA1C的HEK293细胞上L型钙离子流变化，以及雄激素睾酮（10μM）对其的影响。再分别加入ER治疗药物异丙肾上腺素（10μM）和奎尼丁（5μM），观察药物对钙离子流的影响，绘制电流-电压（I-V）曲线，电压依赖的稳态激活曲线(steady state activation, SSA)和电压依赖的稳态失活曲线(steady state inactivation, SSI)。 8.统计学分析：所有涉及统计的实验数据均采用SPSS19.0软件包统计学分析软件进行分析。计量资料以均数±标准误（-x±s）表示，两组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P值＜0.05具有统计学意义，P值＜0.01具有显著统计学意义。结果： 1.成功诱导CACNA1C-Q1916R突变，经测序验证CACAN1C基因第5747位碱基A突变为碱基G，其它位点未发生突变。 2.免疫组化结果显示携带CACNA1C基因突变的先证者心室肌组织Cav1.2蛋白表达水平低于正常对照组织（*P＜0.05），异源性表达突变Cav1.2的总mRNA表达水平较野生型Cav1.2低（*P＜0.01），且在细胞总蛋白、模蛋白和浆蛋白各水平的表达均下降（*P＜0.05）。 3.细胞免疫荧光结果显示突变型Cav1.2蛋白转运功能正常，但整体荧光强度更弱。 4.全细胞膜片钳结果显示突变组钙电流密度较野生组显著降低，降低有统计学意义（*P＜0.05，**P＜0.01），SSA和SSI两组间无差异；睾酮（10μM）可显著降低收起

关键词 : 心原性猝死早期复极综合征 CACNA1C基因基因突变 L型钙离子通道分子遗传学

3. 药用植物奇蒿的化学成分研究

[学位论文] 李璐南昌大学医学院 2017年硕士导师: 叶阳共160页

摘要 : 奇蒿(Artemisia anomala S.Moore)为菊科蒿属多年生草本植物，主要产于江苏、浙江、安徽、江西、福建、广西等省。奇蒿的干燥带花全草，中药商品名“南刘寄奴”。《本草纲目拾遗》记载，奇蒿味苦性温，传统药用功效主要为疗伤止血，破血通淤，消食化积... 展开

关键词 : 蒿属二萜倍半萜乙醇提取体外活性

4. TIM信号通路干预对小鼠实验性结肠炎的作用及机制研究

[学位论文] 熊慧芳南昌大学医学院 2017年博士导师: 谢勇共153页

摘要 : 目的: 炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）是一组病因不明的慢性肠道炎症性疾病，它包括溃疡性结肠炎（ Ulcerative Colitis, UC）和克罗恩病（Chron’sdisease, CD），IBD的发病率逐年上升，已成为一种全球性疾病，预测在未来10年，... 展开目的: 炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）是一组病因不明的慢性肠道炎症性疾病，它包括溃疡性结肠炎（ Ulcerative Colitis, UC）和克罗恩病（Chron’sdisease, CD），IBD的发病率逐年上升，已成为一种全球性疾病，预测在未来10年，IBD患者将发生指数级增长，中国将拥有超过150万的IBD患者。BD的病因和发病机制尚不清楚，肠道细菌及其代谢产物作用于基因易感性宿主使之产生异常的免疫反应在IBD肠道炎症的起始和持续发展中起着重要的作用。目前已明确，Toll样受体4（Toll-like receptor4, TLR4）信号通路在IBD免疫反应异常中发挥重要作用，但其具体调控机制尚未完全阐明。2001年McIntire发现了新的基因家族Tim（T cell Ig domain and mucin domain）家族，Tim基因家族蛋白对调控 T细胞的应答起重要作用，是近年来发现的调控免疫异常的重要蛋白之一，是调节Th免疫反应的核心环节，并且与TLRs信号通路有密切关系。Tim-1主要表达在分化成熟的Th2细胞，Tim-4是Tim-1的天然配体，表达于树突状细胞（Dendritic cell，DC）表面；与Tim-1相反，Tim-3优先表达于活化的 Th1细胞表面，近年来也发现 Tim-3少量表达于巨噬细胞（Macrophage， Mφ）、DC细胞等表面，半乳凝素-9（Galectin-9, Gal-9）是Tim-3配体。因此，除了调节Th免疫，由于Tim-4及Tim-3可以表达于固有免疫细胞，而TLRs作为广泛表达在固有免疫细胞中的受体，Tim蛋白是可以通过调节TLRs信号通路而调节机体的免疫炎症反应。目前，Tim相关研究主要集中在风湿免疫性疾病及皮肤移植中，在炎症性肠病的相关研究较少，Tim蛋白及其配体在 IBD发生发展中的作用，与Th免疫反应及TLRs信号通路变化的关系目前尚不清楚。为此，本文通过体内研究分别明确Tim-1配体Tim-4及Tim-3配体Gal-9对不同小鼠实验性结肠炎模型的肠道炎症及TLR4信号通路的影响；通过体外研究明确Tim-3在巨噬细胞中的作用，及其对TLRs信号通路的影响；明确不同实验性结肠炎模型的肠道菌群结构及Gal-9对肠道菌群的影响。旨在探讨Tim配体干预在不同结肠炎模型中的作用及其调控机制，为临床 IBD的防治寻找有效靶点提供理论与实验依据。材料与方法: （一）Tim-1信号通路干预对实验性结肠炎的作用及机制（1）实验分组：50只Balb/c鼠随机分为以下5组（每组10只）： ①正常对照组（n=10） ② TNBS模型组（n=10） ③ TNBS+Tim-4组（n=10） ④ DSS模型组（n=10） ⑤ DSS+Tim-4组（n=10）（2）实验性结肠炎模型的建立： ① TNBS诱导小鼠实验性结肠炎模型的建立：6～8周龄的Balb/c小鼠于禁食、不禁饮24小时后，用3.5F导管从肛门插入肠道深约5.5cm，灌注TNBS/50%乙醇溶液100μl，之后将小鼠倒置60秒，于第8天处死小鼠。 ② DSS诱导小鼠实验性结肠炎模型的建立：6～8周龄的Balb/c小鼠自由饮用5%DSS溶液7天，于第8天处死小鼠。（3）Tim-4干预方法：建模第3天开始给予10ug Tim-4/0.4ml PBS腹腔内注射，连续给药5天；模型对照组小鼠给予0.4ml PBS腹腔注射。（4）各项指标检测： ①各组小鼠疾病活动指数DAI的变化 ② H&E染色观察肠黏膜病理学变化及炎症程度 ③实时荧光定量PCR法检测结肠组织中TLR4、MyD88、Tim-1基因的表达 ④免疫组化法检测肠黏膜内TLR4、MyD88、NF-κB p65、Tim-1蛋白的表达 ⑤ Wes全自动蛋白分析检测结肠组织中TLR4、MyD88、Tim-1蛋白的表达 ⑥多重磁珠酶免分析法检测血清中IL-1β、IFN-γ及IL-6的含量（二）Tim-3信号通路干预对实验性结肠炎的作用及机制（1）实验分组：50只Balb/c鼠随机分为以下5组（每组10只）： ①正常对照组（n=10） ② TNBS模型组（n=10） ③ TNBS+Gal-9组（n=10） ④ DSS组（n=10） ⑤ DSS+Gal-9组（n=10）（2）实验性结肠炎模型的建立：同上（3）Gal-9干预方法：建模第3天开始给予10ugGal-9/0.4ml去离子水腹腔内注射，连续给药5天；模型对照组小鼠给予0.4ml去离子水腹腔注射。（4）各项指标检测： RT-PCR检测Tim-3 mRNA表达 IHC及全自动蛋白分析检测Tim-3蛋白表达量其余同上（不检测Tim-1）（三）Tim-3干扰对巨噬细胞内TLR4/NF-κB信号通路的影响（1）实验分组：分为以下4组 ①空白对照组：RAW264.7细胞 ② Tim-3干扰对照组：shRNA干扰Tim-3的RAW264.7细胞 ③ LPS刺激组：RAW264.7细胞+LPS刺激 ④ Tim-3干扰LPS刺激组：shRNA干扰Tim-3的RAW264.7细胞+LPS刺激根据以上分组，给予终浓度为100ng/ml的LPS作用24h（独立重复试验3次）。（2）检测指标： Wes全自动蛋白分析检测细胞Tim-3、TLR4、MyD88、pNF-κB p65蛋白表达（四）小鼠实验性结肠炎肠道菌群结构的变化及Gal-9的干预影响（1）实验分组：同第（二）部分（2）收集各小鼠的新鲜粪便样品，采用QIAamp DNA分离试剂盒提取细菌基因组DNA （3）将收集的DNA样本送检华大基因有限公司，扩增目标16S rRNA片段，混样、纯化、建库后上机，基于Illumina Miseq高通量测序平台对V4可变区进行双末端测序，应用生物信息学方法分析肠道菌群结构的变化。结果：（一） Tim-1信号通路干预对实验性结肠炎的作用及机制 1．Tim-4干预对实验性结肠炎DAI的影响 TNBS及DSS模型组小鼠DAI均显著高于正常组（P＜0.01），给予Tim-4干预后，TNBS及 DSS模型组 DAI仍显著高于正常组（P＜0.05，P＜0.01），TNBS+Tim-4组 DAI有改善，但与未干预组差异无统计学意义（p＞0.05）；而DSS+Tim-4组 DAI有上升趋势，与未干预组差异亦无统计学意义（p＞0.05）。 2．Tim-4干预对实验性结肠炎肠黏膜组织病理学及炎症程度的影响 TNBS模型组小鼠的结肠炎症程度、病变深度、隐窝破坏均显著高于正常对照组（P＜0.01）。Tim-4干预后，小鼠病理组织学评分均有改善，隐窝破坏与正常组无显著差异（p＞0.05），但炎症程度及病变深度仍显著高于正常组（P＜0.01， P＜0.05），炎症程度评分显著低于未干预组（P＜0.05）。无论有无Tim-4干预， DSS组小鼠结肠炎症程度、病变深度、隐窝破坏均显著高于正常对照组（P＜0.01）；Tim-4干预后，病理组织学评分均有加重，但与未干预组比较差异无统计学意义（p＞0.05）。 3．Tim-4干预对结肠黏膜内TLR4/NF-κB信号通路的影响（1） Tim-4干预对结肠黏膜组织Tim-1表达的影响 RT-PCR结果显示：与正常对照组相比，TNBS小鼠肠黏膜组织的 Tim-1 mRNA表达上调，但差异无统计学意义（p＞0.05）；DSS模型组小鼠肠黏膜组织的Tim-1 mRNA表达显著高于正常对照组（P＜0.01）。给予Tim-4干预处理后， TNBS组和DSS组Tim-1 mRNA表达升高，与正常组比较有显著差异（P＜0.01）；两模型组药物干预前后的mRNA表达差异无统计学意义（p＞0.05）。 IHC结果显示：在炎细胞中，TNBS组及DSS组Tim-1表达均高于正常对照组，其中DSS组与正常对照组差异显著（P＜0.01）。Tim-4干预后，TNBS组Tim-1表达升高，而DSS组Tim-1蛋白表达下降，均显著高于正常对照组（P＜0.05， P＜0.01）；与Tim-4未干预组均有差异，差异无统计学意义。 Wes蛋白分析结果显示：无论是TNBS模型还是DSS模型组，小鼠肠粘膜组织的Tim-1均高表达，显著高于正常对照组（P＜0.01）；Tim-4干预后，TNBS模型组中Tim-1表达稍增高，而DSS组Tim-1下降明显，与未干预组有明显差异（P＜0.01），而与正常对照组无统计学差异（p＞0.05）。（2） Tim-4干预对结肠黏膜组织TLR4表达的影响 RT-PCR结果显示：TNBS及DSS模型组小鼠肠黏膜组织的TLR4 mRNA表达均显著高于正常对照组（P＜0.05，P＜0.01）。给予Tim-4干预处理后，TNBS模型组TLR4表达下调，且与正常对照组比较无显著差异（p＞0.05）；DSS模型组TLR4表达仍有上调趋势，与正常对照组比较有显著差异（P＜0.01）；但两模型组药物干预前后mRNA表达的差异无统计学意义（p＞0.05）。 IHC结果显示：无论有无 Tim-4干预，在腺细胞和炎细胞中，TNBS组及DSS组TLR4表达均显著高于正常对照组（P＜0.01）。Tim-4干预后，TNBS组TLR4表达下降，显著低于未干预组（P＜0.05），而在DSS组TLR4蛋白表达仍有上升趋势，但与未干预组比较差异无统计学意义（p＞0.05）。 Wes蛋白分析结果显示：与正常对照组相比，TNBS模型组及 DSS模型组结肠黏膜组织TLR4蛋白表达均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。给予Tim-4干预后，TNBS组TLR4表达下调，与未干预组有显著差异（P＜0.01），而与正常对照组无显著差异（p＞0.05）；DSS组TLR4上调明显，与正常对照组有显著差异（P＜0.01），而与未干预组差异无统计学意义（p＞0.05）。（3） Tim-4干预对结肠黏膜组织MyD88表达的影响 RT-PCR结果显示：TNBS及DSS模型组小鼠肠黏膜组织的MyD88 mRNA表达均显著高于正常对照组（P＜0.01）。Tim-4干预后，TNBS组MyD88表达下调，显著低于未干预组（P＜0.05），且与正常对照组比较无显著差异（p＞0.05）；DSS模型组MyD88表达增加，显著高于未干预组（P＜0.01），与正常对照组比较有显著差异（P＜0.01）。 IHC结果显示：无论有无 Tim-4干预，在腺细胞和炎细胞中，TNBS组及DSS组 MyD88表达均显著高于正常对照组（P＜0.01）。Tim-4干预后，TNBS组MyD88表达下降，显著低于未干预组（P＜0.05），而DSS组MyD88蛋白表达仍有上升趋势，但与未干预组比较差异无统计学意义（p＞0.05）。 Wes蛋白分析结果显示：与正常对照组相比，TNBS模型组结肠黏膜组织MyD88蛋白表达显著升高（P＜0.01）；给予Tim-4干预后，TLR4表达下调，但与未干预组无显著差异（p＞0.05）。与正常对照组相比，DSS模型组结肠黏膜组织MyD88蛋白表达升高（p＞0.05），但给予Tim-4干预后，MyD88上调明显，与正常对照组有显著差异（P＜0.05）。两组模型中，Tim-4干预前后差异无统计收起

关键词 : 结肠炎 Tim信号通路 Toll样受体巨噬细胞肠道菌群

5. 基于肝硬化数据库研究症状性细菌性腹水的病原学特征与快速筛查模型及其临床应用

[学位论文] 朱龙川南昌大学医学院 2017年博士导师: 朱萱共153页

摘要 : 目的：症状性细菌性腹水（symptomatic bacterascites, SB）是一种变异的自发性细菌性腹膜炎（spontaneous bacterial peritonitis, SBP），有感染表现，但腹水多形核细胞（polymorphonuclear, PMN）计数＜250个/mm3，仅能通过腹水细菌培养阳性... 展开目的：症状性细菌性腹水（symptomatic bacterascites, SB）是一种变异的自发性细菌性腹膜炎（spontaneous bacterial peritonitis, SBP），有感染表现，但腹水多形核细胞（polymorphonuclear, PMN）计数＜250个/mm3，仅能通过腹水细菌培养阳性确诊。由于腹水培养常耗时数日，故临床难以及时发现SB。目前，缺乏早期诊断SB的有效方法。本研究目的是通过建立肝硬化数据库来总结SB病原学特点和探索SB快速筛查模型及其临床应用。方法： 1.创建肝硬化数据库参照国内外肝硬化相关诊疗指南，经专家讨论确定数据库拟收集的内容，然后运用Epi InfoTM7软件创建肝硬化数据库并录入临床数据。 2.症状性细菌性腹水的病原菌及耐药特征从创建的数据库中筛选腹水培养阳性的SBP病例，分为SB组与常规SBP组（腹水PMN计数≥250个/mm3）。比较两组病原菌构成、耐药特征及预后。 3.血降钙素原与C反应蛋白筛查症状性细菌性腹水从创建的数据库中选取符合要求的肝硬化病例，分为 SB组与非感染性腹水组。利用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线的曲线下面积（area under curve，AUC）来评价PCT及CRP筛查SB的价值。 4.症状性细菌性腹水快速筛查模型的构建与临床应用从创建的数据库中选取符合条件的肝硬化病例，分为 SB组与非感染性腹水组，通过单因素分析及二分类Logistic回归分析筛选自变量并构建SB快速筛查模型。将SB快速筛查模型判为阳性的新入院肝硬化腹水患者随机分为试验组（给予抗菌素治疗）与对照组（不予抗菌素治疗）。前瞻性比较两组的治疗应答率、病情变化及预后。结果: 1.创建肝硬化数据库建立的肝硬化数据库包括患者基本信息界面、病史资料界面、主诉体检界面、实验室检查界面、影像学及内镜检查界面、内科治疗界面、干预治疗界面、病情评估及预后界面、并发症界面及出院随访界面，具有数据录入、数据自检、自动计算等功能，目前已录入568例住院肝硬化患者的临床数据。 2.症状性细菌性腹水的病原菌及耐药特征共收集SB组103例和常规SBP组110例。SB组病原以革兰阳性菌为主（占55.3%，53/103），常规SBP组以革兰阴性菌为主（占71.8%，79/110），差异有统计学意义（2=16.18，P＜0.01）。革兰阳性菌和革兰阴性菌对未加酶抑制剂的第三代头孢菌素的耐药分级，在SB组为安全和预警，在常规SBP组为安全和不宜经验用药。患者30天内死亡率在SB组为36.9%（38/103），在常规SBP组为43.6%（48/110），差异无统计学意义（2=1.005，P=0.316）。 3.血降钙素原与C反应蛋白筛查症状性细菌性腹水共纳入SB组30例与非感染性腹水组51例。PCT、CRP、两者串联、两者并联诊断SB的AUC依次为0.725、0.848、0.737、0.706，两两差异无统计学意义（P＞0.05）。诊断SB的最佳界值，PCT为≥0.43ng/mL，CRP为≥12.76mg/L。依据上述界值，PCT、CRP、两者串联、两者并联诊断SB的敏感性依次为70.0%、70.0%、53.3%、86.7%，特异性依次为76.5%、88.2%、94.10%、74.5%。 4.症状性细菌性腹水快速筛查模型的构建与临床应用回顾性纳入SB组103例与非感染性腹水组204例，利用其临床数据构建了以体温、腹部压痛、血中性粒细胞百分比、血总胆红素、凝血酶原时间及腹水有核细胞计数为参数的SB快速筛查模型。模型诊断SB的AUC为0.939，最佳诊断界值为筛查评分≥0.328，其敏感性为86.4%，特异性为92.2%。前瞻性纳入试验组12例与对照组12例。试验组有6例全程使用头孢他啶，另6例因治疗反应不佳而调整抗菌素。至研究终点时，两组治疗应答率分别为66.7%（8/12）与16.7%（2/12），差异有统计学意义（Fisher精确概率法，P=0.036）。试验组中腹水PMN计数≥250个/mm3、腹水有核细胞计数≥500个/mm3、腹水培养阳性、确诊 SB、发热且腹痛、腹部压痛或/和反跳痛以及肝性脑病的事件发生率均低于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；两组均无死亡事件。结论: 1. Epi InfoTM7软件构建肝硬化数据库切实可行，能有效协助临床医生进行临床科研。 2. SB与常规SBP的病原菌构成及耐药特点不同，而预后相当。经验性初治，未加酶抑制剂的第三代头孢菌素可用于SB，但不宜用于常规SBP。 3.血 PCT、CRP及两者联合对 SB均有良好的诊断价值且各有优势，临床可根据实际需要合理选用。 4. SB快速筛查模型可有效识别SB病例，对该模型判为阳性的患者使用抗菌素可使其获益。收起

关键词 : 肝硬化腹膜炎细菌性腹水病原学特征降钙素原 C-反应蛋白筛查模型早期诊断

6. FAT10调控翻译延伸因子eEF1A1表达及对肿瘤细胞影响的机制研究

[学位论文] 刘秀霞南昌大学医学院 2014年博士导师: 邵江华共152页

摘要 : 目的：探讨FAT10通过调控eEF1A1对肿瘤细胞生物学特性的影响；分析FAT10对eEF1A1泛素化降解的影响；确定FAT10和Ub与eEF1A1结合的赖氨酸位点；分析FAT10对eEF1A1的调控机制。最终明确FAT10调控eEF1A1的分子机制及对肿瘤细胞生物学行为的影响。方... 展开目的：探讨FAT10通过调控eEF1A1对肿瘤细胞生物学特性的影响；分析FAT10对eEF1A1泛素化降解的影响；确定FAT10和Ub与eEF1A1结合的赖氨酸位点；分析FAT10对eEF1A1的调控机制。最终明确FAT10调控eEF1A1的分子机制及对肿瘤细胞生物学行为的影响。方法：一、沉默人各种肿瘤细胞 MHCC-97H、Huh7、PANC-1、MB231和SW620中FAT10的表达，通过实时荧光定量PCR和Western blot检测FAT10和 eEF1A1 mRNA和蛋白的表达水平。双荧光素酶报告基因检测 FAT10对eEF1A1启动子的影响。荧光共振能量转移技术(FRET)确认 FAT10和 eEF1A1的相互作用。在沉默FAT10表达的基础上恢复eEF1A1表达，通过CCK8增殖实验检测MHCC-97H和Huh7细胞增殖能力，通过Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力；通过流式细胞仪检测细胞周期的变化。二、泛素化实验和放射菌酮实验检测FAT10对eEF1A1泛素化降解的影响；构建eEF1A1不同大小的截短体质粒，通过免疫共沉淀确定FAT10和Ub与eEF1A1的结合片段；将与FAT10和Ub结合的eEF1A1片段内的赖氨酸通过定点突变技术全部突变成精氨酸，再运用免疫共沉淀确定FAT10和Ub与eEF1A1的结合位点。三、体外竞争实验、免疫共沉淀和GST pull down技术确定FAT10和Ub与eEF1A1的结合情况；GST pull down、免疫共沉淀和激光共聚焦确定FAT10和eEF1A1与Rpn10的相互作用；体外蛋白表达、体外竞争实验、免疫共沉淀和GST pull down技术确定FAT10和eEF1A1与Rpn10之间结合的相关性。结果：一、RT-PCR以及Western blot结果表明：肿瘤细胞MHCC-97H、Huh7、PANC-1、MB231和SW620中干扰FAT10的表达，可观察到eEF1A1的表达也随之下降；但干扰eEF1A1的表达，却未观察到FAT10的表达的变化。并在稳定低表达FAT10的肿瘤细胞中得到进一步的验证，干扰FAT10表达的同时过表达eEF1A1，可观察到eEF1A1的表达水平得以恢复。为分析肿瘤细胞FAT10对eEF1A1调控的机制，通过双荧光素报告基因检测发现FAT10对eEF1A1基因启动子的活性没有调控作用，而通过FRET确认FAT10和eEF1A1的存在相互作用。流式细胞周期和CCK8增殖实验分析，干扰FAT10组、干扰eEF1A1组较正常对照组，肿瘤细胞阻滞在G1期，增殖有明显抑制（P＜0.05）；而干扰FAT10过表达eEF1A1组较干扰FAT10组、干扰eEF1A1组有明显的恢复（P＜0.05）。Transwell侵袭实验结果显示，分别干扰FAT10和eEF1A1后与对照组细胞相比，肿瘤细胞的侵袭能力均有明显抑制（P＜0.05），但过表达 eEF1A1后，这种抑制作用并没有得到恢复。二、FAT10可以抑制eEF1A1的泛素化降解。通过免疫共沉淀确定FAT10和Ub与eEF1A1的II和III结合域相结合；进一步将eEF1A1分成大小不同的截短体，通过免疫共沉淀确定FAT10和Ub与eEF1A1的284-332和394-462两个片段相互作用；最后通过点突变技术和免疫共沉淀确定eEF1A1的290、313、318、330、395、408、439、443、444、450、453、457、460和462十四个赖氨酸位点在与FAT10和Ub结合中起重要作用。三、确定FAT10和泛素与 eEF1A1结合相同位点，并存在相互竞争拮抗作用。并证实 Ub和eEF1A1复合物能够被26S蛋白酶体亚基Rpn10所识别，而FAT10和eEF1A1复合物却不能与26S蛋白酶体亚基Rpn10结合，从而保护eEF1A1不被泛素-蛋白酶体降解。结论： FAT10与eEF1A1的结合拮抗其泛素化降解，进而稳定eEF1A1蛋白，最终影响肿瘤细胞的生物学特性。Rpn10识别FAT10/底物蛋白复合物是决定FAT10降解或稳定的底物蛋白的关键。对阐明FAT10在肿瘤细胞中的作用机制具有重要意义，为进一步明确肿瘤的发生发展机制提供理论依据，并为人们提出合理的预防和治疗方案奠定理论基础。收起

关键词 : FAT10蛋白 eEF1A1蛋白泛素化肿瘤细胞分子机制生物学特性

7. O-GlcNAc糖基化修饰Nav1.5蛋白参与糖尿病心肌损伤所致心律失常

[学位论文] 余鹏南昌大学医学院 2017年博士导师: 洪葵共144页

摘要 : 糖尿病已经成为威胁全球人类健康的主要威胁之一，并且其心血管并发症是糖尿病患者死亡的重要原因。糖尿病性心脏损伤（diabetic heart injury，DHI）是糖尿病的常见心血管并发症，其定义为在无冠状动脉硬化和高血压等疾病情况下，单纯由糖尿病长期发... 展开糖尿病已经成为威胁全球人类健康的主要威胁之一，并且其心血管并发症是糖尿病患者死亡的重要原因。糖尿病性心脏损伤（diabetic heart injury，DHI）是糖尿病的常见心血管并发症，其定义为在无冠状动脉硬化和高血压等疾病情况下，单纯由糖尿病长期发展而诱发的心肌结构和功能的损伤。DHI早期的临床表现以心肌舒张功能障碍为主，晚期以心肌收缩功能障碍为主。长期不可逆的DHI最终导致多种心律失常的发生，如：室性早搏（室早）和室性心动过速（室速），甚至心源性猝死。上述疾病进程中的详细分子机制以及涉及的相关信号通路十分复杂。DHI诱发的心律失常其可能的分子机制如下：内质网应激、细胞内钙稳态失衡和细胞内离子稳态的离子通道功能及表达异常等。尤其是离子通道蛋白和功能在其中的作用及相关调控机制仍然知之甚少。最新研究显示， O-GlcNAc糖基化通过参与调控心肌细胞内代谢和细胞的昼夜节律，从而促进了心律失常的易感性增加。我们前期结果发现，链脲佐菌素（STZ）诱导的 DHI表型中的心肌细胞胞浆内钠离子通道蛋白 Nav1.5表达增加，蛋白的 O-GlcNAc糖基化水平升高。然而，O-GlcNAc糖基化Nav1.5蛋白在DHI诱导的心律失常中的作用及其具体分子机制尚未阐明。目的：尽管研究发现O-GlcNAc糖基化在DHI的发生和发展中发挥重要作用，然而其在DHI诱导的心律失常的分子机制仍不明确。为了研究O-GlcNAc糖基化及钠离子通道蛋白Nav1.5在DHI诱导的心律失常中的作用，我们通过在体动物和离体细胞实验证实O-GlcNAc糖基化Nav1.5参与DHI诱导的心律失常，并探讨其潜在的分子机制，为将来防治糖尿病患者发生心律失常的干预靶点提供理论依据。研究方法：本研究动物实验所采用实验方法包括：血糖和无创血压测定、超声心动图（Vevo2100）、心电图（ECG）采集与分析（TA11CTA-F40）、程序性电刺激实验（Model2352 Programmable Stimulator）、real-time RT-PCR、Western Blot免疫共沉淀、免疫荧光标记和组织学染色等。在体动物实验将大鼠分为两组：对照组（Control）和糖尿病组（STZ）。本研究细胞实验所采用实验方法包括原代心肌细胞分离和培养、HEK-293T细胞培养、高糖（HG：25 mM/L）处理、全细胞膜片钳实验与分析（EPC10，HEKA）、real-time RT-PCR、Western Blot、免疫共沉淀、免疫荧光标记、腺病毒载体构建和质粒的分离纯化等。离体细胞实验分为以下六组：正常糖浓度处理组（normal glucose；NG）、高糖浓度处理组（high glucose；HG）、NG+O-GlcNAc糖基化促进剂组（Thiamet-G；Th-G）、HG+Th-G组、NG+O-GlcNAc糖基化抑制剂组（deoxynorleucine；Don）和HG+Don组。结果： 1.在STZ诱导的糖尿病模型中，结果显示心脏扩大（心脏重量/体重比值增加、心房钠尿肽和脑利钠肽的mRNA水平升高、左室内径等显著增加）和心脏舒张和收缩功能障碍（射血分数、短轴缩短率和E/A比值均下降）。 2.我们通过DSI植入术采集心电图并分析结合心外膜程序性电刺激实验，进一步明确DHI的心律失常易感性。实验结果发现糖尿病大鼠QT间期和QTc等明显延长，并且电刺激后糖尿病大鼠可诱发持续室速。此外，3个月的糖尿病大鼠诱发的室速持续时间显著长于对照组。 3.在STZ诱导的糖尿病模型中，我们发现O-GlcNAc糖基化水平以时间依赖性升高。在2，3个月的糖尿病大鼠心脏中总蛋白的O-GlcNAc糖基化水平升高伴OGT蛋白表达增加和OGA蛋白表达减少。此外，我们通过分离提纯胞浆和胞膜蛋白，分别进行免疫印迹实验发现2，3个月糖尿病大鼠心脏的胞浆内Nav1.5的表达几乎增加2倍。然而，其在心肌细胞的胞膜表达显著降低。 4.通过HG处理原代心肌细胞体外模拟在体DHI表型，进一步检测上述细胞蛋白的表达水平。通过免疫印迹技术发现HG处理后心肌细胞的胞浆中Nav1.5表达升高，而细胞膜上的Nav1.5表达减少。 5.通过对在体动物心脏组织和离体细胞提取物进行免疫共沉淀实验，首次发现Nav1.5蛋白是O-GlcNAc糖基化的靶蛋白，并且HG处理的原代心肌细胞或糖尿病心肌内O-GlcNAc糖基化的Nav1.5明显增多。 6.利用HBP信号通路中的特异性抑制剂（Deoxynorleucine, Don）和激动剂（Thiamet-G, Th-G）、过表达外源性OGT和RNA干扰内源性OGT以双向调控O-GlcNAc糖基化水平在调节 Nav1.5的表达和分布中发挥重要作用：促进O-GlcNAc糖基化水平升高导致 Nav1.5的胞内聚集，跨膜转运障碍；抑制O-GlcNAc糖基化水平结果正相反。 7.体外全细胞膜片钳实验发现，HG或药物处理后Nav1.5的O-GlcNAc糖基化增加引起心脏钠通道功能紊乱（钠电流下降，激活时间延长和晚钠电流升高）。 8.通过检测Nav1.5结合蛋白Nedd4-2、SAP-97和MOG1表达水平发现，HG环境中Nedd4-2和SAP-97蛋白表达下降，并且O-GlcNAc糖基化Nav1.5增多使Nav1.5和Nedd4-2/SAP-97之间的相互结合也明显减少。结论： 1.糖尿病心肌损伤时其心律失常易感性明显升高。 2.在体和离体实验均证实高糖引起O-GlcNAc糖基化修饰Nav1.5水平升高。 3.Nav1.5的 O-GlcNAc糖基化修饰水平升高引起 Nav1.5与其调控蛋白Nedd4-2/SAP-97的相互结合下降，并导致Nav1.5转运与分布异常。 4.最终导致快钠离子通道电流降低和晚钠电流增强。收起

关键词 : 糖尿病心肌损伤心律失常 Nav1.5蛋白 O-GlcNAc糖基化

8. 长QT综合征的分子遗传致病机制研究

[学位论文] 周慧南昌大学医学院 2013年博士导师: 洪葵共143页

摘要 : 随着人类全基因组测序的完成，遗传病的致病基因的发现及研究进展，更新了人们对许多疾病致病机制的认识。离子通道病的遗传学研究是当今国内外心血管疾病的前沿与热点。过去的20年，随着心脏离子通道病的基础-临床转化研究取得的重要进展，已极大改变... 展开随着人类全基因组测序的完成，遗传病的致病基因的发现及研究进展，更新了人们对许多疾病致病机制的认识。离子通道病的遗传学研究是当今国内外心血管疾病的前沿与热点。过去的20年，随着心脏离子通道病的基础-临床转化研究取得的重要进展，已极大改变了临床医生对这类疾病诊断和治疗的困境。如发现了一些编码心脏离子通道及相关蛋白的基因突变可导致多种遗传性心律失常，包括长QT综合征(LQTS)、短QT综合征（SQTS）、Brugada综合征等，并解析了其相关分子机制。尤其值得关注的是，理想的基因检测可以判别患者的危险分层，尤其是明确家族成员中携带基因突变的高风险“沉默”患者。但需要认识到，基因测试可以揭示患者基因组序列变化，但判别突变是否为患者疾病的临床病因依旧是一个极大挑战。遗传性LQTS是最常见亦是最早发现的心脏离子通道病，由遗传基因突变而引起的一种心肌复极延迟性疾病，主要表现为QT间期延长与之继发的恶性心律失常，发作性晕厥和心原性猝死（SCD）。LQTS分子遗传机制的研究取得了显著进展，根据其致病基因发现的先后顺序，分为13种基因型。自Keating等对LQTS做出开创性的发现以来，KCNQ1，KCNH2，SCN5A基因的特异性突变被确定为LQTS基因缺陷的基础。除遗传因素外，某些药物、电解质紊乱、器质性心脏病、体温异常、代谢紊乱及某些神经系统疾病等因素均可通过素影响心脏离子通道功能，而影响心肌细胞的复极化过程而导致QTc延长，以及尖端扭转型室性心动过速（TdP）和室颤（VF），甚至SCD，称之为获得性LQTS。此外，年龄、性别因素亦具有一定的影响作用。获得性LQTS因恶性心律失常所致的猝死是院内SCD的重要因素之一，应引起临床医师的高度警惕。 LQTS致病基因的发现是心血管疾病遗传研究领域一个里程碑的研究成果，不同基因型LQTS患者的临床表现具有显著差异，猝死风险不一。在某些情况下，突变“热点（hot spots）”可增加心律失常的风险。尽管这些研究结果可用于引导基因治疗但存在一定困难，由于携带同一致病突变的家系成员的外显率不一致，临床表型可存在显著差异，这可能是由于基因修饰引起了表型的改变。许多基因可影响心肌细胞复极化过程，影响相同LQTS致病基因携带者的临床表型。 LQTS致病基因的发现是了解心肌细胞正常复极化过程分子机制的至关重要的第一步，可辅助指导LQTS新疗法的筛选，亦有助于进一步了解心律失常致病机制，为患者最有效的治疗及预防措施提供理论依据。越来越多的研究显示，除基因突变，一些常见的单核苷酸多态性（SNPs）亦可直接或间接引起心肌细胞离子通道功能发生变化。这些SNPs单独表达或许并不影响离子通道的表达、跨膜转运和电生理特性，可能通过基因内互补作用调节基因突变对离子通道的作用，增加突变携带者的患病风险及加重其临床表型。在获得性QT间期延长因素作用下，SNPs可进一步加重离子通道功能障碍，类似“多次打击学说”，导致复极储备能力显著下降而引起QT间期延长。故SNPs可显著增加遗传性和获得性LQTS的遗传易感性。SNPs存在显著的种族和地区差异，因此，了解国人LQTS及易感人群SNPs有助于指导临床风险分层和个体化治疗，预防高危患者SCD。目的：我国已发现包括KCNQ1、KCNH2、SCN5A、KCNE1、KCNJ5在内的5个LQTS致病基因共43个基因突变，为了进一步完善国人LQTS致病基因突变数据库，为国人LQTS基因筛查奠定理论基础，及解析国人LQTs综合征致病基因突变的特征性，本课题拟以临床体表心电图QT间期延长的患者及其家系成员为研究对象，应用遗传检测技术寻找基因突变，探讨其电生理致病机制、基因型与临床特征的关系及其与致恶性心律失常的关系，揭示遗传性LQTS的遗传致病机制。材料方法：收集临床资料及实验标本：收集体表心电图QT间期延长患者临床资料，排外温度、电解质异常及某些药物因素等所致复极化异常引起的QT间期延长。采集患者及其家系成员外周血标本。随访：对本研究收集的LQTS患者进行追踪随访，了解其治疗情况和恶性心血管事件。基因检测：对所采集的外周血，应用酚-氯仿抽提法提取其全基因组DNA，设计遗传性LQTS13个已知致病基因及候选基因KCNA5（KV1.5）、KCND3（KV4.3）、KCNE2（MiRP1）、KCNJ12（Kir2.2）、KCNJ11（Kir6.2）、KCNJ8（Kir6.1）、KCNJ4（Kir2.3）及KCNJ3（Kir3.1）的外显子引物，应用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增候选致病基因的外显子序列， PCR扩增所得产物进行纯化，纯化产物直接测序。将测序结果与NCBI GenBank中BLAST程序进行同源性比较，对所发现的基因变异体与200例同种族背景正常人群相同基因测序结果进行比对，以明确所发现变异为基因突变或多态性，并分析突变类型及有无氨基酸改变。定点诱变及细胞转染：根据突变位点的碱基序列设计诱变引物，应用重组PCR技术进行定点突变诱导，PCR扩增产物进行基因测序以明确定点诱变是否成功及正确。将携带野生型基因序列、定点突变的基因序列的质粒分别导入pcDNA3.1+细胞表达载体，对突变质粒进行测序验证，确定克隆是否成功，从而筛选出阳性克隆。对SCN5A基因突变，将脂质体与野生型质粒或突变SCN5A质粒转染入人胚肾293细胞（ human embryonic kidney293 cells， HEK293），简称HEK293细胞，重组基因进行稳定表达。应用同样的方法，将野生型及突变型KCNQ1质粒分别转染入经SV40病毒基因转化的非洲绿猴肾成纤维细胞系（African green monkey kidney derived cell line），简称COS-7细胞，重组基因进行稳定表达。膜片钳技术功能分析：已转染了野生型质粒或突变质粒的HEK293细胞及COS-7细胞于37℃培养箱中分别培养24、48小时。应用膜片钳电生理技术，在全细胞模式下，分别记录野生型、突变型离子通道的电流变化。分析比较野生型、突变型离子通道的电流特征及活性动力学特征，对实验数据进行统计学分析比较。结果： 1、临床资料共收集到符合条件的9例LQTS先证者，男性3人，女性6人，年龄11～87岁，其中3个LQTS家系，共20人。通过临床资料对比发现，（1）基因突变先证者发病年龄明显小于无基因突变患者（31.8±8.82 VS49.11±8.65，P＜0.01），差异有显著统计学意义；（2）基因突变先证者与无基因突变患者的平均PR间期（156ms±18.33ms VS170ms±19.15ms）、平均QRS间期（92ms±8ms VS115ms±23.63ms）、平均TpTe时限（176ms±19.39ms VS200ms±31.62ms，P＞0.05）差异无统计学意义。（3）基因突变先证者的平均QTc（578.92ms±38.18ms VS541.98ms±42.38ms）呈现较长趋势。 2、遗传基因检测在9个 LQTS先证者中，发现5位患者携带5个不同基因突变，3个为SCN5A基因突变，分别为V411M、S705F和R1846H；2个KCNQ1基因突变分别为R380S和W305L。其中，SCN5A基因R1846H突变和KCNQ1基因W305L突变为国际首次报道。9例临床诊断LQTS患者，基因突变率高达55.56%（2个LQT1，3个LQT3）。基因突变先证者家系成员的突变携带率为41.18%。共发现7个基因的26个SNPs，包括（1）9个SCN5A基因SNPs：A29A、704+21CA、1339-24G>A、H558R、P1089L、R1192Q和D1818D；（2）9个KCNJ12基因SNPs：S15L、R39Q、R40H、R81R、I100V、R118V、P156L、Q192H和G216G；（3）3个KCNQ1基因SNPs：S546S、1591+36A>G和1686+114T>G；（4）1个KCNJ2基因SNP：L382L；（5）1个KCND3基因SNP：1107+15C>A；（6）1个KCNA5基因SNP：R550R；（7）2个KCNJ11基因SNPs：A190A和V337I。KCNJ12-R118V和KCNA5-R550R为首次报道。除SCN5A-D1818D，9位LQTS先证者SNPs发生率高于本研究同地区、种族健康人群对照组。无突变先证者SCN5A-P336P发生概显著高于CSAgilent报道。无突变先证者KCNQ1-S546S发生率显著高于本研究对照组、亚洲和欧洲人群概率。本研究 LQTS先证者发生 SCN5A-H558R、SCN5A-1089L、SCN5A-R1192Q均高于正常对照组，NCBI-SNP-Geneview未见相关报道。 3、细胞电生理检测结果 SCN5A基因突变对Nav1.5通道的作用：（1）电流密度-电压关系显示，SCN5A基因V411M、S705F和R1846H突变均使Nav1.5通道发生功能增强性改变。与野生型相比，V411M、S705F和R1846H突变电流峰值分别增加1.28倍、46%和58.09%，差异有统计学意义；（2）稳态激活曲线（SSA）结果显示，测试脉冲在-50mv时， V411M突变Nav1.5通道激活百分比显著高于野生型（85.00%±7.43%VS41.50%±2.60%，P＜0.01），差异有统计学意义，S705F和R1846H突变不改变Nav1.5通道的SSA曲线；（3）稳态失活曲线（SSI）显示，V411M和R1846H突变不改变Nav1.5通道的SSI，电压在-110mV到-70mV范围时，S705F使Nav1.5通道SSI曲线左移，标准电流减少（P均＜0.05），差异有统计学意义。 KCNQ1基因突变对Kv7.1通道的作用：R380S突变致Kv7.1通道功能丧失。与野生型相比，从-50 mv始，随测试脉冲电压增加，R380S突变Kv7.1通道电流显著降低，P＜0.05，差异有统计学意义。与野生型相比，R380S突变不改变Kv7.1通道的SSA特性。讨论： LQTS是一种常见的遗传性心律失常综合征，其致病基因的发现是了解心肌细胞正常复极化过程分子机制的至关重要的第一步，不仅有助于LQTS的基因诊断，而且可指导开发新的治疗措施。不同基因型LQTS的遗传背景不同，临床表型也有很大的差异。除遗传因素外，各种可导致QT间期延长的后天因素亦是获得性LQTS危险分层的影响因素，且各种易感因素具有累加作用，危险因素越多，患病风险及SCD风险越高。获得性LQTS因恶性心律失常所致的猝死是院内SCD的重要因素之一。本研究在9例不同家系来源的先证者中发现5例先证者携带5个不同基因突变，3个SCN5A基因杂合错义突变，分别为V411M、S705F和R1846H；2个KCNQ1杂合错义基因突变，R380S与W305L。其中，SCN5A-R1846H突变与KCNQ1-W305L突变均为国际首次报道。电生理研究发现， SCN5A基因V411M、S705F和R1846H突变使Nav1.5离子通道发生不同程度的功能增强性改变，KCNQ1基因R380S突变导致Kv7.1离子通道功能显著丧失。基因突变先证者发病年龄明显小于无基因突变先证者，其平均QTc有大于无基因突变患者的趋势。不同LQTS患者遗传背景不同，临床表现亦可有很大差异。致病基因是临床表型的主要决定因素，但基因突变的位置亦可影响临床表型的严重程度。3个SCN5A基因突变（V411M、S705F和R1846H）与2个KCNQ1基因突变（R380S和W305L）先证者的EC 收起

关键词 : 长QT综合征基因突变离子通道心律失常分子遗传致病机制 KCNQ1基因 SCN5A基因

9. 裸花紫珠化学成分及其胶囊质量标准研究

[学位论文] 黄波南昌大学医学院 2014年硕士导师: 罗跃华;魏孝义共141页

摘要 : 裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook. et Arn)为马鞭草科紫珠属植物,主要分布于海南、广东、广西地区,同时也是一种海南道地药材,生于平地至海拔1200 m的山坡、谷地、溪旁林中或灌木丛中。其全草包括根、茎、花、皮均可入药,有消炎、止血、收敛、凉血... 展开裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook. et Arn)为马鞭草科紫珠属植物,主要分布于海南、广东、广西地区,同时也是一种海南道地药材,生于平地至海拔1200 m的山坡、谷地、溪旁林中或灌木丛中。其全草包括根、茎、花、皮均可入药,有消炎、止血、收敛、凉血、散瘀消肿、清热解毒、驱风祛湿之功效。用于肺咯血、胃肠出血、鼻衄、牙龈出血、创伤出血、风湿肿痛等症。裸花紫珠干燥叶经粉碎后用乙醇回流提取,提取物依次以石油醚、乙酸乙酯正丁醇萃取。利用多种柱层析、反相中压液相色谱、高效液相色谱等分离方法,从正丁醇萃取部位分离获得了20个化合物。利用波谱和化学方法,确定19个化合物的化学结构,包括5个黄酮:木犀草素(1)、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、木犀草苷(3)、木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、柯伊利素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5),2个梓醇类:裸花紫珠梓醇A(6)、6'-O-caffeoyl-3,4-dihydrocatalpol(7)、3个环烯醚萜类:nudifloside(8)、7-O-E-p-coumaroyl-8-epi-loganic acid(9)、7-O-E-p-coumaroyl-gardoside(10),1个二萜皂苷:3,12-O-β-D-二吡喃葡萄糖基-11,16-二羟基-8,11,13-三烯(11)、及6个三萜皂苷:2α,3α,19α,24-四羟基齐墩果烷-12-烯-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(12)、2α,3α,23,29-四羟基乌苏酸-12,19-二烯-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(13)、2a,3a,19a,23-四羟基齐墩果烷-12-烯-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(14)、2α,3α,19α,23-四羟基齐墩果烷-12-烯-28-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(15)、2α,3α,19α-三羟基齐墩果烷-12-烯-28-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(16)、2α,3α,19α-三羟基乌苏烷-12-烯-28-O-β-D-木糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(17),1个苯丙素苷类:异毛蕊花糖苷(18)、1个甾体类:β-胡萝卜苷(19);其中化合物6、7、9、10、12、13、15、16为新化合物,化合物5、11、14为首次从紫珠属中分离得到。根据裸花紫珠用药特点及前人从裸花紫珠中分离得到的化合物药理筛选活性结果,本论文在抗肿瘤、降血糖、保肝细胞药理模型上,对这些分离鉴定的单体化合物进行了活性筛选。药理结果如下:在抗肿瘤活性筛选中,化合物6对人肝肿瘤细胞株(HepG2)和人胃腺癌细胞株(BGC-823)两种肿瘤细胞表现出细胞毒活性,IC50值分别为3.37和2.49μM。在降血糖活性筛选中,19个化合物几乎没有显示出对PTP1B酶的抑制活性;对α-葡萄糖苷酶,化合物3,6和18表现出一定的抑制活性,抑制率分别为31.7%,58.7%和35.8%;在保肝活性筛选中,化合物6、9、10、12、13、14和16表现出对WB-F344大鼠肝上皮干细胞样细胞的D-半乳糖胺诱导的毒性中有显著的保肝活性。本论文采用薄层色谱法(TLC),与裸花紫珠对照药材对比进行鉴别;采用高效液相色谱法测定木犀草苷和毛蕊花糖苷的含量。选用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液(15:85),流速为1.0 mL/min,木犀草苷检测波长为350 nm,毛蕊花糖苷检测波长为330 nm,柱温为35℃。结果 TLC法鉴别专属性强,斑点清晰,分离度好;木犀草苷和毛蕊花糖苷进样量分别在2.26~90.24μg/mL(R2=0.9997),8.90~356.2μg/mL(R2=0.9994),范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系,平均回收率(n=9)分别为99.57%(RSD为1.98%)和97.46%(RSD为1.32%)。结果显示该方法准确、简便、重复性好,可作为裸花紫珠胶囊的质量标准控制。对裸花紫珠胶囊质量标准研究旨在为其质量进行控制,以保证企业能生产出质量稳定、均一、合格的产品,保障人们用药安全。收起

关键词 : 裸花紫珠化学成分质量标准抗肿瘤性能

10. 多肽酰肼偶联法的优化及其在环肽和糖蛋白合成中的应用

[学位论文] 田小波南昌大学医学院 2017年硕士导师: 黄蔚共140页

摘要 : 糖蛋白是一类广泛存在于机体内的天然蛋白，在各种生命活动中起着至关重要的作用。其来源于蛋白的一种重要翻译后修饰——糖基化修饰。机体内，前体蛋白经糖基化修饰生成具有各种糖型的糖蛋白复合体，从而发挥多样的生物学功能。与此同时，由于生物合... 展开

关键词 : 糖蛋白多肽酰肼硫酯交换天然化学链接多肽偶联