摘要: 糖尿病已经成为威胁全球人类健康的主要威胁之一，并且其心血管并发症是糖尿病患者死亡的重要原因。糖尿病性心脏损伤（diabetic heart injury，DHI）是糖尿病的常见心血管并发症，其定义为在无冠状动脉硬化和高血压等疾病情况下，单纯由糖尿病长期发... 展开 糖尿病已经成为威胁全球人类健康的主要威胁之一，并且其心血管并发症是糖尿病患者死亡的重要原因。糖尿病性心脏损伤（diabetic heart injury，DHI）是糖尿病的常见心血管并发症，其定义为在无冠状动脉硬化和高血压等疾病情况下，单纯由糖尿病长期发展而诱发的心肌结构和功能的损伤。DHI早期的临床表现以心肌舒张功能障碍为主，晚期以心肌收缩功能障碍为主。长期不可逆的DHI最终导致多种心律失常的发生，如：室性早搏（室早）和室性心动过速（室速），甚至心源性猝死。上述疾病进程中的详细分子机制以及涉及的相关信号通路十分复杂。DHI诱发的心律失常其可能的分子机制如下：内质网应激、细胞内钙稳态失衡和细胞内离子稳态的离子通道功能及表达异常等。尤其是离子通道蛋白和功能在其中的作用及相关调控机制仍然知之甚少。最新研究显示， O-GlcNAc糖基化通过参与调控心肌细胞内代谢和细胞的昼夜节律，从而促进了心律失常的易感性增加。我们前期结果发现，链脲佐菌素（STZ）诱导的 DHI表型中的心肌细胞胞浆内钠离子通道蛋白 Nav1.5表达增加，蛋白的 O-GlcNAc糖基化水平升高。然而，O-GlcNAc糖基化Nav1.5蛋白在DHI诱导的心律失常中的作用及其具体分子机制尚未阐明。 目的： 尽管研究发现O-GlcNAc糖基化在DHI的发生和发展中发挥重要作用，然而其在DHI诱导的心律失常的分子机制仍不明确。为了研究O-GlcNAc糖基化及钠离子通道蛋白Nav1.5在DHI诱导的心律失常中的作用，我们通过在体动物和离体细胞实验证实O-GlcNAc糖基化Nav1.5参与DHI诱导的心律失常，并探讨其潜在的分子机制，为将来防治糖尿病患者发生心律失常的干预靶点提供理论依据。 研究方法： 本研究动物实验所采用实验方法包括：血糖和无创血压测定、超声心动图（Vevo2100）、心电图（ECG）采集与分析（TA11CTA-F40）、程序性电刺激实验（Model2352 Programmable Stimulator）、real-time RT-PCR、Western Blot免疫共沉淀、免疫荧光标记和组织学染色等。在体动物实验将大鼠分为两组：对照组（Control）和糖尿病组（STZ）。本研究细胞实验所采用实验方法包括原代心肌细胞分离和培养、HEK-293T细胞培养、高糖（HG：25 mM/L）处理、全细胞膜片钳实验与分析（EPC10，HEKA）、real-time RT-PCR、Western Blot、免疫共沉淀、免疫荧光标记、腺病毒载体构建和质粒的分离纯化等。离体细胞实验分为以下六组：正常糖浓度处理组（normal glucose；NG）、高糖浓度处理组（high glucose；HG）、NG+O-GlcNAc糖基化促进剂组（Thiamet-G；Th-G）、HG+Th-G组、NG+O-GlcNAc糖基化抑制剂组（deoxynorleucine；Don）和HG+Don组。 结果： 1.在STZ诱导的糖尿病模型中，结果显示心脏扩大（心脏重量/体重比值增加、心房钠尿肽和脑利钠肽的mRNA水平升高、左室内径等显著增加）和心脏舒张和收缩功能障碍（射血分数、短轴缩短率和E/A比值均下降）。 2.我们通过DSI植入术采集心电图并分析结合心外膜程序性电刺激实验，进一步明确DHI的心律失常易感性。实验结果发现糖尿病大鼠QT间期和QTc等明显延长，并且电刺激后糖尿病大鼠可诱发持续室速。此外，3个月的糖尿病大鼠诱发的室速持续时间显著长于对照组。 3.在STZ诱导的糖尿病模型中，我们发现O-GlcNAc糖基化水平以时间依赖性升高。在2，3个月的糖尿病大鼠心脏中总蛋白的O-GlcNAc糖基化水平升高伴OGT蛋白表达增加和OGA蛋白表达减少。此外，我们通过分离提纯胞浆和胞膜蛋白，分别进行免疫印迹实验发现2，3个月糖尿病大鼠心脏的胞浆内Nav1.5的表达几乎增加2倍。然而，其在心肌细胞的胞膜表达显著降低。 4.通过HG处理原代心肌细胞体外模拟在体DHI表型，进一步检测上述细胞蛋白的表达水平。通过免疫印迹技术发现HG处理后心肌细胞的胞浆中Nav1.5表达升高，而细胞膜上的Nav1.5表达减少。 5.通过对在体动物心脏组织和离体细胞提取物进行免疫共沉淀实验，首次发现Nav1.5蛋白是O-GlcNAc糖基化的靶蛋白，并且HG处理的原代心肌细胞或糖尿病心肌内O-GlcNAc糖基化的Nav1.5明显增多。 6.利用HBP信号通路中的特异性抑制剂（Deoxynorleucine, Don）和激动剂（Thiamet-G, Th-G）、过表达外源性OGT和RNA干扰内源性OGT以双向调控O-GlcNAc糖基化水平在调节 Nav1.5的表达和分布中发挥重要作用：促进O-GlcNAc糖基化水平升高导致 Nav1.5的胞内聚集，跨膜转运障碍；抑制O-GlcNAc糖基化水平结果正相反。 7.体外全细胞膜片钳实验发现，HG或药物处理后Nav1.5的O-GlcNAc糖基化增加引起心脏钠通道功能紊乱（钠电流下降，激活时间延长和晚钠电流升高）。 8.通过检测Nav1.5结合蛋白Nedd4-2、SAP-97和MOG1表达水平发现，HG环境中Nedd4-2和SAP-97蛋白表达下降，并且O-GlcNAc糖基化Nav1.5增多使Nav1.5和Nedd4-2/SAP-97之间的相互结合也明显减少。 结论： 1.糖尿病心肌损伤时其心律失常易感性明显升高。 2.在体和离体实验均证实高糖引起O-GlcNAc糖基化修饰Nav1.5水平升高。 3.Nav1.5的 O-GlcNAc糖基化修饰水平升高引起 Nav1.5与其调控蛋白Nedd4-2/SAP-97的相互结合下降，并导致Nav1.5转运与分布异常。 4.最终导致快钠离子通道电流降低和晚钠电流增强。 收起