中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

排序：

[学位论文] 刘佳内蒙古大学 2018年硕士导师: 包斯琴共68页

摘要 : 子代基因组可以来源于父本及母本双方，或者其中一方（即孤雄或孤雌），后者的遗传方式在自然界中尤为罕见，但却为探索生物的隐性遗传特征提供了极为重要的资源。本研究主要在小鼠二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立及新型多能性干细胞系的诱导两个方面进... 展开子代基因组可以来源于父本及母本双方，或者其中一方（即孤雄或孤雌），后者的遗传方式在自然界中尤为罕见，但却为探索生物的隐性遗传特征提供了极为重要的资源。本研究主要在小鼠二倍体孤雌胚胎干细胞系的建立及新型多能性干细胞系的诱导两个方面进行了探讨。首先，采用化学成分明确的培养液来培养小鼠二倍体孤雌囊胚，培养液成分包括：基础培养基N2B27、激活素A（ActivinA）、成纤维细胞生长因子（bFGF）以及血清替代物（KSR），这种建系方法可以高效率的获得小鼠孤雌胚胎来源的上胚层干细胞（parthenogenetic epiblast like stem cell，下文称之为Pa-AFSCs），该细胞系的形态特征及部分鉴定结果如下： 1.克隆形态以及碱性磷酸酶染色结果显示，Pa-AFSCs与上胚层干细胞（Epiblaststem cells,EpiSCs）相似。 2.免疫荧光染色结果显示：Pa-AFSCs表达Nanog的细胞明显少于对照组胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs），而其表达Gata6的细胞明显多于完全阴性的ESCs，H3K27me3的结果显示几乎全部Pa-AFSCs细胞皆表现为一条X染色体处于失活的状态。 3.实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果显示：Pa-AFSCs的Oct4,Nanog,Gata4,Gata6和Eomes的转录水平与EpiSCs相差无几，但滋胚层标志基因Elf5和细胞周期相关基因cMyc的转录水平明显高于EpiSCs。 4.畸胎瘤及嵌合体实验结果：畸胎瘤的实验结果显示未观察到明显畸胎瘤形成。实验获得1枚6.5天嵌合原肠胚，胚胎嵌合率4.2%，嵌合部位胚外外胚层（extraembryonic ectoderm，EXE）。 5.生长曲线结果显示，来源于ICR小鼠的Pa-AFSCs生长速度明显高于来源于129小鼠的Pa-AFSCs。随后，进一步将得到的Pa-AFSCs置于包含ActivinA、骨形态发生蛋白BMP4、CHIR99021、白血病抑制因子LIF（即ABCL培养体系）的培养液中进行诱导培养，得到新型小鼠多能性干细胞系，命名为：Ja-ASCs。其克隆形态以及碱性磷酸酶染色结果与对照组ESCs相比，无明显差别，可稳定传代至40代以上。免疫荧光染色结果显示：与对照组Pa-AFSCs相比，失活的X染色体重新活化。RT-qPCR实验结果显示：比较于Pa-AFSCs，Oct4,Nanog和Klf4的表达上调，Gata4和中胚层标志基因Sox17的转录下调。另外发现Cdx2的转录水平明显高于对照组Pa-AFSCs。嵌合体结果显示Ja-ASCs不具备贡献着床后胚胎的能力。综上所述，本实验由小鼠孤雌激活的囊胚建立了两种新型的细胞系：Pa-AFSCs和Ja-ASCs。从形态特征以及干细胞的某些特征来看，Pa-AFSCs接近于EpiSCs，而Ja-ASCs更类似于ESCs。然而Pa-AFSCs无法形成畸胎瘤，Ja-ASCs也无法贡献于着床后的嵌合体胚胎中，具体分子机制还有待进一步研究。收起

关键词 : 二倍体孤雌胚胎上胚层干细胞隐性遗传诱导机制

2. Klf5诱导小鼠上胚层样干细胞向滋养层干细胞转分化技术的建立

[学位论文] 邬欣宇中国科学院大学 2022年硕士导师: 秦宝明共82页

摘要 : 小鼠早期胚胎可以分离出多种干细胞，如来自着床前囊胚内细胞团(ICM)的小鼠胚胎干细胞(mESCs)、着床后胚胎的小鼠上胚层干细胞(mEpiSCs)及来自滋养外胚层(TE)的小鼠滋养外胚层干细胞(mTSCs)等，这些体外干细胞系都是研究胚胎发育的重要模型。而精确控... 展开

关键词 : 上胚层样干细胞滋养层干细胞转分化技术 Klf5蛋白基因调控

3. 啮齿类动物上胚层来源的干细胞多能性的研究

[学位论文] 董明珠中国科学院大学 2012年博士导师: 周琪共86页

摘要 : 啮齿类动物的胚胎干细胞(ESCs)与上胚层干细胞(EpiSCs)是建系来源不同的两大多能性干细胞。啮齿类动物的胚胎干细胞主要依靠LIF和BMP4来维持多能性状态，其具有体内外分化成三胚层细胞的能力;啮齿类动物的胚胎干细胞可以通过二倍体嵌合参与胚胎发育过... 展开啮齿类动物的胚胎干细胞(ESCs)与上胚层干细胞(EpiSCs)是建系来源不同的两大多能性干细胞。啮齿类动物的胚胎干细胞主要依靠LIF和BMP4来维持多能性状态，其具有体内外分化成三胚层细胞的能力;啮齿类动物的胚胎干细胞可以通过二倍体嵌合参与胚胎发育过程，又可以通过四倍体补偿获得可育的动物后代。啮齿类动物上胚层干细胞则依靠Activin/Nodal和bFGF-ERK维持其未分化的状态，其具有体内外分化得到三胚层细胞的能力，但不能参与正常的胚胎发育过程。在生物学特性方面，啮齿类动物上胚层干细胞与人胚胎干细胞表现出相似的特征。本论文着重阐述了以下几个问题:(1)如何建立稳定的啮齿类动物上胚层干细胞系;(2)上胚层干细胞与胚胎干细胞是否能够相互转化;(3)上胚层能否建立单倍体细胞系。首先，我们建立了符合标准的小鼠上胚层干细胞系，表现在:(1)细胞集落的形态为单层扁平状;(2)碱性磷酸酶染色为阴性;(3)表达多能性基因Oct4、Nanog，及上胚层特异的标记分子;(5)能够形成拟胚体，能够分化成三胚层来源的各种细胞类型;(6)能够形成畸胎瘤;(7)雌性细胞系，其中一条X染色体处于失活状态;(8)不能够形成嵌合鼠等。同时，我们还尝试建立大鼠上胚层干细胞系，将其在体外培养了3代。其次，小鼠ESCs在EpiSC培养体系下可分化形成小鼠EpiSCs。相应地，通过EpiSC培养体系直接转换为小鼠ESC培养体系的方法，我们可以实现小鼠EpiSCs向小鼠ESC状态的转化;在含有20％ Knockout血清的小鼠ESC培养体系下，比在含有15％胎牛血清的小鼠ESC培养体系下，EpiSCs向ESCs转化的效率会显著性升高;EpiSCs转化得到的reverted ESCs符合ESC的鉴定标准，如reverted ESCs表达多能性标记基因Oct4、Nanog，及ESC特异标记分子Rex1，不表达EpiSC特异标记分子Cer1;碱性磷酸酶染色为阳性;具有二倍体嵌合和四倍体补偿能力等。最后，通过单精注射到去核的卵母细胞构建单倍体胚胎的方法，我们在体外建立了单倍体胚胎干细胞系;在体外培养中，单倍体胚胎干细胞需要通过流式分选单倍体的方法维持单倍体状态;与二倍体胚胎干细胞一样，孤雄单倍体胚胎干细胞同样具有多能性;为了验证处于EpiSC状态的多能性干细胞是否可以建立单倍体干细胞系，我们将孤雄单倍体胚胎干细胞在EpiSC体系下体外诱导分化，最终得到了2株单倍体上胚层干细胞系;这两株单倍体上胚层干细胞都符合上胚层干细胞鉴定的所有标准;为了研究上胚层干细胞进一步分化后，其单倍体状态是否可以维持，我们将单倍体上胚层干细胞做神经分化，最终得到了Nestin阳性的单倍体神经样细胞，证明了上胚层干细胞分化早期的细胞可以存在单倍体。综上，我们建立了符合标准的小鼠上胚层干细胞系;通过培养体系的转换，我们能够将小鼠胚胎干细胞与上胚层干细胞进行体外相互转化;建立了单倍体上胚层干细胞系，证明了上胚层仍然存在单倍体，推动了单倍体细胞维持机制的研究工作。收起

关键词 : 上胚层干细胞胚胎干细胞单倍体重编程多能性啮齿类动物

4. 小鼠体细胞重编程及多能性建立的机理研究

[学位论文] 郭琳中国科学院大学 2014年博士导师: 裴端卿共119页

摘要 : 诱导多能干细胞(iPSCs)技术是近年来干细胞与再生医学领域的重大突破，也是目前使用最广泛的体细胞重编程方法。起初，由于存在诱导时间长、诱导效率低以及克隆质量差等问题，iPSCs的机理研究进展缓慢。随着iPSCs技术的成熟，使其机理研究成为可能。本... 展开

关键词 : 诱导多能干细胞体细胞重编程染色体拷贝数变异上胚层干细胞再生医学

5. BMP信号在胚胎干细胞神经诱导过程中的功能

[学位论文] 张克兢中国科学院上海生命科学研究院 2009年博士导师: 景乃禾共94页

摘要 : 哺乳动物早期神经发育经历了内细胞团(Inner Cell Mass，ICM)、上胚层(Epiblast)和神经外胚层(Neuroectorderm)等三个阶段。内细胞团细胞在体外培养可以得到全能性的小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)，而上胚层细胞在体外培养可以得到多潜能... 展开

关键词 : 神经诱导上胚层胚胎干细胞神经发育内细胞团基因表达细胞分化

6. 小分子IWR1维持小鼠上胚层干细胞自我更新的机制探究

[学位论文] 孙元元安徽大学 2017年硕士导师: 刘大海共73页

摘要 : 干细胞是一类具有自我更新能力的细胞，在体外培养条件下可无限增殖，同时保持着分化为不同类型细胞和组织的潜能，现已成为研究基因功能、筛选药物和制造疾病动物模型的强有力工具之一，具有巨大的应用前景。小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Ce... 展开干细胞是一类具有自我更新能力的细胞，在体外培养条件下可无限增殖，同时保持着分化为不同类型细胞和组织的潜能，现已成为研究基因功能、筛选药物和制造疾病动物模型的强有力工具之一，具有巨大的应用前景。小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cells，mESCs)是第一株在体外成功建立的干细胞系。此后，人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells，hESCs)系也得以成功构建。2007年，科学家们又从小鼠着床后的囊胚上胚层中分离得到一种新型的干细胞——小鼠上胚层干细胞(mouse Epiblast Stem Cells，mEpiSCs)。值得关注的是，mEpiSCs与mESCs虽然具有相同的物种属性，但二者在生物学特性上存在较大差异，而mEpiSCs与hESCs之间却表现出许多更为相似的特性。由于人源性，hESCs无法进行嵌合体实验或其它涉及伦理问题的研究，在此种情况下，mEpiSCs则可以充当相应空白领域的补充材料，而对于mEpiSCs的深入研究，也是对整个干细胞研究领域的拓展，有利于扩大人们对于干细胞内部信号调控网络的认识。早期分离得到的mEpiSCs被培养在人工合成培养基(chemically definedmedium，CDM)中，并加入细胞因子激活素A(Activin A)和成纤维细胞生长因子2（fibroblast grow factors-2，FGF2）来维持细胞的自我更新状态。但此种条件下培养的细胞易出现生长缓慢、不耐受单细胞消化、易凋亡等问题。经改进后的培养条件，以10％胎牛血清(FBS)含量的DMEM培养基为基础，加入ActivinA、bFGF、IWR1（Axin蛋白的稳定剂）以及Y27632（ROCK激酶的抑制剂）这四种细胞因子和小分子化合物，可以显著提高mEpiSCs的存活能力。然而，Activin A+bFGF+IWR1+Y27632培养条件由于涉及因子种类过多，不利于后续对细胞内信号通路与调控机制的深入探究，且培养成本较高。我们在前期工作中尝试对mEpiSCs的培养条件作进一步改进与优化，最终得到仅添加IWR1和Y27632即可使mEpiSCs维持在自我更新状态的最佳培养条件。为探究IWR1和Y27632维持mEpiSCs自我更新的作用机制，设计对照实验，检测IWR1条件下和Y27632条件下，mEpiSCs中各基因的差异化表达程度，并以此为基础，筛选出每种小分子可能作用的靶基因。考虑到课题周期的限制，我们首先选取IWR1作为研究对象，筛选出其在细胞中可能作用的下游靶基因为Foxd3，并利用另一种小分子CHIR99021与IWR1对于Wnt/β-catenin信号通路所具有的拮抗作用来设计反向实验，证明了Foxd3的表达与IWR1之间确实具有相关性。下一步，围绕Foxd3来设计实验，探究IWR1调控mEpiSCs自我更新状态的中间媒介。相关实验分两个方向展开:其一，构建包含目的基因的过表达载体，转染并借此在细胞内上调Foxd3的表达量，观察其能否替代IWR1来维持细胞的自我更新状态;其二，利用shRNA干扰的方法，在mEpiSCs内下调Foxd3的表达水平，观察细胞是否出现分化现象。在mEpiSCs中分别上调与下调Foxd3后，通过形态观察、细胞计数、qRT-PCR、免疫荧光等实验手段来检测mEpiSCs的自我更新水平与生长情况。结果显示，在缺乏IWR1的培养条件下，与对照组细胞相比，过表达Foxd3后的mEpiSCs能够维持正常的形态特征，且生长速率明显提高，qRT-PCR实验可检测到细胞内自我更新标志基因Esrrb、Nanog和Oct4的正常表达，且代表不同胚层的分化基因，如Gata6、Mixl1和Nestin的表达量未出现变化，而在免疫荧光实验中也可检测到自我更新标志基因Oct4和Nanog的蛋白表达产物，说明上调Foxd3的表达量，能够替代IWR1的作用来维持mEpiSCs处于自我更新状态;另一方面，在IWR1存在的条件下，下调Foxd3后的mEpiSCs与对照组相比，细胞形态出现异常，自我更新标志基因Oct4和Nanog在转录与蛋白水平上的表达量均出现下调，且内胚层、中内胚层与中胚层的标志基因表达水平出现显著上升，说明下调Foxd3的表达量，能够使IWR1维持mEpiSCs自我更新的作用失效。由此可以推断Foxd3作为小分子IWR1的下游靶基因，在其调控mEpiSCs生长与内部信号通路的过程中发挥着重要作用，是维持细胞自我更新状态的关键环节。该研究结果扩大了目前人们对于维持mEpiSCs自我更新分子机制的理解，有利于后续对其展开进一步的基础研究与应用，同时可以为探究人胚胎干细胞以及其他种类多能性干细胞的自我更新机制提供线索。收起

关键词 : 上胚层干细胞自我更新药物筛选动物模型人工合成培养基免疫荧光实验

7. 神经谱系的分化与转分化研究

[学位论文] 桑励思中国科学院大学 2013年硕士导师: 周琪共95页

摘要 : 神经系统的疾病是对人类健康威胁最为严重的疾病之一，除了外界损伤造成的神经系统损害外，神经系统自身病变导致的神经退行性死亡更是目前难以治疗的严重影响人类健康的疾病。神经退行性疾病的病因较为复杂，一般认为是年龄衰老，遗传易感或环境毒素... 展开神经系统的疾病是对人类健康威胁最为严重的疾病之一，除了外界损伤造成的神经系统损害外，神经系统自身病变导致的神经退行性死亡更是目前难以治疗的严重影响人类健康的疾病。神经退行性疾病的病因较为复杂，一般认为是年龄衰老，遗传易感或环境毒素造成。神经系统疾病的传统治疗方法是通过药物或其它手段导入促进神经再生的因子或促使周围细胞分泌这些因子，来达到治疗的目的。然而这些治疗方式往往效果不明显，无法彻底消除病因且具有副作用，例如使得胶质细胞过度增殖引发胶质细胞瘤。而向神经损伤部位移植入神经干细胞，其不仅可以在病变部位不断增殖，产生新的神经元，重建神经网络，而且可以持续分泌营养因子或保护因子，是一种非常有前景的治疗方式。目前获得神经干细胞的方式主要有三种，一种是体内分离，第二种是由多能性干细胞分化，第三种是从其它成体细胞直接转化。后两种方法可以获得大量细胞，因此是细胞治疗的主要依靠的方式。在本论文中，我们建立了一种具有较高分化效率的神经干细胞诱导分化体系。我们利用不同因子诱导上胚层干细胞(Epiblast Stem Cells，EpiSCs)向神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)分化，发现由SB431542和FGF8共同连续处理7天，即可获得纯度100％的NSCs。这些NSCs具有向神经谱系各个方向分化的潜能。由体内来源的多能性干细胞诱导分化获得神经干细胞仍存在道德伦理争论和异体排斥等问题。而诱导多能性干细胞(induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs的)虽然可以避开这些问题，但由此分化获得的神经干细胞中可能残存的未分化的细胞也具有潜在的致瘤危险。直接重编程（direct reprogramming）是不经由多能性阶段直接由一种分化的细胞转变为另一种分化的细胞的过程，由于没有多能性的中间阶段，因而避开了致瘤的危险。此前的研究发现利用Mash1，Bm2，Hes1，Sox2，Id1，Pax6，Ngn2，K1f4和c-Myc9个因子可以诱导小鼠睾丸支持细胞(Sertoli Cells)或尾尖成纤维细胞(Tail Tip Fibroblast，TTF)直接转化为诱导神经前体细胞(induced Neural Progenitor Cells，iNPC)。在本研究中，我们尝试在Sertoli的诱导中去除Sox2因子或在TTF的诱导中去除Idl因子，最终成功地获得了具有分化成成熟的中脑多巴胺能神经元能力的iNPC细胞系。与9因子诱导的iNPC细胞系不同，这些细胞倾向于聚团生长和分化。在Shh和FGF8预处理的诱导分化条件下，这两个iNPC细胞系能高比例的分化为多巴胺能神经元，并且建立起Synapsin阳性的神经突触。使得这些细胞系有望用于治疗帕金森氏症。此外，本论文还对小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞（Androgenic HaploidEmbryonic Stem Cells，AHESCs）的神经分化能力进行了验证。单倍体细胞可用于基因修饰以作为研究基因功能的工具，或建立疾病模型，或对病变的基因进行修复以用作细胞治疗。我们证实AHESCs具有向NSCs分化的能力，且这些AHESCs来源的NSCs9.9％能够分化成Tuj1和Map2阳性的早期神经元。然而，AHESCs经由拟胚体（Embryoid Bodys，EBs）分化12天获得的NSCs已经完全二倍体化。为了获得单倍体的分化细胞，我们以孤雄单倍体上胚层干细胞(Androgenetic Haploid Epiblast Stem Cells，AHEpiSCs)起始分化4天获得了Nestin阳性的单倍体细胞系，这些细胞经过连续流式分选单倍体后，100％表达Nestin，并且不表达Oct3/4和Nanog，而其中52.3％的细胞都是单倍体。综上所述，本论文建立了一种可较高效率由上胚层干细胞向神经干细胞分化的技术体系;尝试对此前建立的直接重编程技术体系进行优化;对孤雄单倍体胚胎干细胞的神经分化能力进行了验证。这些不同来源，不同分化方式获得的NSC细胞系，是具有各自特征的细胞模型，为研究了解神经发育过程，神经干细胞干性维持以及神经分化的机制等提供重要信息。转分化获得的iNPCs和单倍体来源的NSCs也是未来用于神经系统疾病细胞治疗的良好资源。收起

关键词 : 神经干细胞上胚层干细胞诱导分化体细胞直接重编程孤雄单倍体细胞神经系统疾病动物模型