中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 魏超安徽农业大学 2014年硕士导师: 张运海共98页

摘要 : 猪是具有重要经济价值的家畜和研究人类疾病的理想模型。诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)的诞生，为动物遗传资源保护、药物筛选、疾病诊疗以及转基因动物创制等研究提供了一种崭新的材料，在畜牧业、医学和生物学基础研究上... 展开猪是具有重要经济价值的家畜和研究人类疾病的理想模型。诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)的诞生，为动物遗传资源保护、药物筛选、疾病诊疗以及转基因动物创制等研究提供了一种崭新的材料，在畜牧业、医学和生物学基础研究上具有极其重要的学术价值和广阔的应用前景。尽管iPSCs应用仍面临诸多尚未解决的问题，如免疫排斥效应，成瘤性等，制约着该技术的发展，但是这种新的细胞重编程技术为生产新的细胞材料提供了一种可行的方法。本研究借鉴常规iPSCs获取方法，通过可诱导慢病毒系统携带限定性转录因子，使其在猪脂肪干细胞（p ADSCs）中异位表达，将pADSCs诱导为不完全重编程iPSC（猪部分重编程iPSCs，即pP iPSCs），并对其生物学特性进行鉴定，以期为进一步丰富猪多能干细胞获取方案、创制转基因猪或基因修饰猪新材料提供参考依据。本研究包括以下两部分：试验一：猪部分重编程iPSCs的获得：在无饲养层的条件下，利用携带人Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的药物可诱导慢病毒系统感染pADSCs，并在含血清，Lif和bFGF的培养液中传代培养，最终获得了与猪完全重编程iPSCs（pF iPSCs）具有相似形态和增殖活性的部分重编程的iPSCs(pPiPSCs)。相比于pFiPSCs，pPiPSCs具有正常的核型，但呈AP阴性，仅表达Oct4、SSEA-3、SSEA-4，不表达Nanog等与多能性相关的蛋白。同时与多能性相关的基因如Oct4、Sox2、Dnmt3b和CDH1的mRNA表达水平相对较低，而与达到完全重编程状态相关的基因如ESS RB、Lin28和Dppa2则不表达。体外可形成EB，但是EB的形成效率及分化程度较pF iPSCs低，在免疫缺陷鼠内无法形成畸胎瘤。这些结果说明我们成功得获得了部分重编程的iPSCs，但其再分化潜能比较低。试验二： pPiPSCs的生物学特性鉴定。首先，我们比较分析了pP iPSCs和pF iPSCs两种类型的多能性干细胞对源头细胞重编程状态的记忆。通过流式细胞术检测pPiPSCs和pF iPSCs中与脂肪干细胞相关的特征性表面分子CD29、CD90、CD44和CD105的表达，结果显示两株pP iPSCs均表达CD29，但是两株pF iPSCs中仅C4-6 NpiPSCs表达CD29，而其阳性率、表达强度均显著低于pPiPSCs；利用PCR检测pPiPSCs和pF iPSCs中与免疫原性相关的基因，结果表明，pP iPSCs虽表达MHCⅠ，但不表达共刺激分子（CD40和CD86），而pFiPSCs不表达MHCⅠ和共刺激分子；对于与免疫抑制相关的基因，如CCL2和Gatectin1在pPiPSCs与pFiPSCs中均低表达，而MMP1的表达则是pP iPSCs稍高于pF iPSCs。其次，我们还系统研究了两种类型的iPSCs的分化潜能。结果发现，在撤除抑制iPSCs分化的因子后，pP iPSCs与pF iPSCs均可获得贴壁生长的细胞：pPiPSCs撤除DOX后，其分化细胞（pPiPSC-DCs）呈成纤维状，可连续传至20代以上而无明显衰老；pFiPSCs的分化细胞（pFiPSC-DCs）在刚撤除DOX后呈上皮样，传代后呈成纤维状，5代内停止生长；进一步对各分化细胞分别向脂肪和成骨细胞进行诱导，结果显示，在成脂方面，pPiPSC-DCs的蓄酯能力显著高于pF iPSC-DCs，而在成骨方面，pP iPSC-DCs可形成典型的矿化结节，但pF iPSC-DCs则无法向成骨细胞进行分化。流式细胞术检测结果显示，pP iPSC-DCs均表达CD29、CD90和CD44，不表达CD105；而pF iPSC-DCs仅表达CD29和CD44，不表达CD90和CD105，且CD29和CD44阳性率和表达强度均显著低于pP iPSC-DCs。在上述iPSCs分化的细胞中，与免疫相关的基因MHCⅠ均有表达，而CD40仅在pP iPSC-DCs中有弱表达，在pF iPSC-DCs中不表达，CD86在pP iPSC-DCs和pF iPSC-DCs均不表达；CCL2在各分化细胞中均表达，而在pPiPSC-DCs中的19DCs表达量最高，Gatectin1在各株细胞中均表达，但表达量相当，MMP1仅在19DCs中表达；进一步利用单向淋巴实验检测第一代和第三代不同密度pP iPSC-DCs与pF iPSC-DCs的免疫抑制能力，在第一代时各株细胞对小鼠脾脏淋巴细胞均有抑制增殖效应，且该效应随着浓度的增加而增强，除了pF iPSC-DCs中21DCs在1×104/孔和2×104/孔密度时比同浓度的其它分化细胞的抑增殖效应稍低外，同一浓度的其余pP iPSC-DCs与pF iPSC-DCs的免疫抑制效应无明显差异。当细胞传至第三代，各浓度的pP iPSC-DCs比pF iPSC-DCs均体现出明显较高抑增殖效应。这些结果说明相比于pFiPSCs，pP iPSCs具有更高的重编程记忆能力。进一步分析了 pPiPSCs和 pF iPSCs的分化细胞支持克隆胚胎发育的效率。我们分别以其为核供体细胞用于核移植，对所获重构胚发育能力，如卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数进行比较分析。结果显示各株细胞卵裂率差异不显著，但是pP iPSC-DCs中的19DCs囊胚率显著的高于其它分化细胞，且19 DCs来源的囊胚总细胞数显著高于pFiPSC-DCs中30DCs来源的囊胚。这些结果说明以pP iPSC-DCs为核供体，更有利于克隆胚胎的发育。总之，我们首次在无饲养层的条件下建立了猪脂肪干细胞来源的部分重编程iPSCs，并揭示了部分重编程 iPSCs的生物学特性和猪 iPSCs重编程过程中的事件发生，为后续重编程机制的研究、细胞替代治疗和克隆猪的生产提供了新材料。收起

关键词 : 猪脂肪干细胞诱导多能干细胞部分重编程细胞重编程记忆

2. 猪克隆胚胎重编程异常机制及提高其发育效率方法的研究

[学位论文] 王兴旺华南农业大学 2019年博士导师: 吴珍芳共150页

摘要 : 体细胞克隆猪在动物繁育、遗传资源保护以及医学动物模型等方面都有重要的应用价值。然而克隆胚胎在植入前的丢失率超过80%，克隆猪的出生效率只有1%左右。这严重限制了猪克隆技术的应用。小鼠作为模式生物，对其研究更加深入，提高小鼠克隆效率的方法... 展开体细胞克隆猪在动物繁育、遗传资源保护以及医学动物模型等方面都有重要的应用价值。然而克隆胚胎在植入前的丢失率超过80%，克隆猪的出生效率只有1%左右。这严重限制了猪克隆技术的应用。小鼠作为模式生物，对其研究更加深入，提高小鼠克隆效率的方法往往在其他动物克隆中被借鉴。过表达小鼠组蛋白去甲基化酶，可以擦除H3K9me3基因修饰，大幅提高克隆胚胎的发育效率(8% vs 1%)。但其克隆效率和体内出生效率相比仍有较大差距(50%)，这说明还有很多影响克隆胚胎发育效率的机制未被发现。同时，小鼠中提高克隆效率的有效方法在其他动物中不完全适用，这也说明导致克隆效率低有共性原因，也有品种间的特异性。本文拟探索猪克隆胚胎发育异常的分子机制，为研究动物胚胎发育调控机理，提高克隆猪出生效率提供理论依据。项目通过克隆猪KDM4家族基因并构建过表达载体，研究KDM4家族成员对H3K9me3修饰的调控和对猪克隆效率的影响；通过单细胞转录组技术对克隆胚胎、体内同期胚胎研究，利用ATAC-seq技术对供体体细胞进行分析，揭示猪克隆胚胎2细胞和4细胞时期胚胎发育失败的原因；利用基因靶向或者小分子对胚胎异常发育进行调控。主要研究结果如下： (1)成功克隆猪KDM4A、KDM4B、KDM4C和KDM4D基因的编码区，分别为3201、3249、3165和2766bp。成功构建KDM4A、KDM4B、KDM4C和KDM4D基因的真核表达载体，并且能在细胞和胚胎水平显著下调H3K9me3的水平(P<0.05)。KDM4家族基因的表达量与胚胎发育关系无直接关联。猪KDM4家族基因并不能大幅度的提高猪克隆胚胎的发育效率，可能是由于H3K9me3修饰在猪克隆胚胎中处于低水平，不是发育异常和失败的主要原因。 (2)猪成体成纤维细胞的总计检测到25274基因的表达(FPKM>0)，占注释基因的65.96%。对10873个表达基因(FPKM>1)的基因进行功能注释，主要涵盖细胞的周期、基因表达调控、RNA和蛋白组的合成与降解、能量的代谢、细胞的衰老凋亡与自噬。猪成体成纤维细胞的ATAC-seq，总计检测到了20323个peaks，其中67.51%peaks在基因附近。peaks涉及的6620个基因主要富集到细胞周期、大分子的合成与代谢、转录的调控、物质的转运等。猪成体成纤维细胞的基因表达量和转录起始位点和基因区域的染色质开放程度成正相关关系。 (3)体内来源胚胎2细胞、4细胞和8细胞时期通过DEseq2的方法分析得到激活基因数目分别是1461、3316和4348。猪体内胚胎在2细胞时期基因组小范围激活，主要合子基因激活时期为4-8细胞时期。2细胞时期激活的基因主要富集到cGMP-PKG、TGF-beta和Hippo等转录信号通路，4细胞时期就的基因主要富集到RNA的转录合成与成熟以及营养物质的吸收与代谢，8细胞时期的基因主要富集到蛋白的合成以及ATP的合成。体内来源和体外来源的卵母细胞分析总计发现1045个差异基因，相对于体内来源卵母细胞，体外来源卵母细胞中有609个基因发生上调，436个下调。差异基因主要富集到线粒体组成、氧化磷酸化、RNA剪接、RNA降解等通路。利用DEseq2方法对2细胞时期克隆胚胎分析发现。2细胞停滞胚胎NT211相较于NT222和NT22b胚胎都表现出严重的基因激活不足。NT211和NT222的差异基因为4996个，其中1641个上调，3355个下调；NT211和NT22b差异基因为3073，其中917个上调，2156个下调。差异基因被富集到氧化磷酸化、RNA剪接、核糖体合成等。ATAC-seq数据显示，停滞胚胎未激活基因在体细胞中的染色质状态相对开放，暗示NT211胚胎基因未激活原因可能是激活性修饰不足。4细胞停滞胚胎NT243相较于NT24b胚胎，存在在研究的基因激活不足。差异基因为5614个，其中上调基因为1812，下调基因基因为3802。这些基因主要富集在蛋白的合成与转运、物质及能量代谢合成上。ATAC-seq数据显示，停滞胚胎未激活基因在体细胞中的染色质状态相对开放，暗示NT243胚胎基因未激活原因可能是激活性修饰不足。通过WGCNA方法分析2细胞时期克隆胚胎发现，HDAC2和SIRT1基因所在模块和2细胞停滞胚胎NT211显著的正相关。HDAC2和SIRT1具备擦除激活性修饰组蛋白乙酰化的能力，是潜在导致NT211胚胎基因不能激活的关键基因。 (4)利用siRNA下调猪克隆胚胎中HDAC2基因表达和利用CAY10683抑制HDAC2基因均可以显著的提高克隆胚胎的发育效率。利用siRNA下调猪克隆胚胎中SIRT1基因表达和利用EX527抑制SIRT1基因均可以显著的提高克隆胚胎的发育效率。利用HDAC2和SIRT1基因的siRNA同时注射干扰和用CAY10683和EX527进行联合孵育猪克隆重构胚胎均没有对发育效率促进作用的叠加效应。克隆胚胎发育效率的提高可能是由于组蛋白乙酰化水平的提高和DNA甲基化水平的下调而引起的基因组激活水平提高。克隆效率的提高是广泛利用克隆技术的前提。本研究首先验证了KDM4家族并能大幅度的提高猪的克隆效率，说明了克隆异常机制在物种间的异质性；利用胚胎活检结合测序技术，成功为异常克隆胚胎建立了2细胞时期和4细胞时期的正常体内胚胎和克隆正常发育胚胎两个参照，鉴定和验证了HDAC2和SIRT1可能是影响猪克隆早期胚胎发育的关键基因，最终利用siRNA干扰和小分子抑制的方法成功的提高了克隆胚胎的早期发育性能，为进一步提高猪的克隆效率打下了坚实的基础。收起

关键词 : 猪克隆胚胎重编程发育效率

3. 维生素C在诱导重编程中的作用及其机理初步研究

[学位论文] 秦宝明中国科学院研究生院 2010年博士导师: 裴端卿共88页

摘要 : 近年来,诱导多能干细胞(iPSCs)的成功建立为再生医学研究走向临床应用开辟了一条崭新的道路。但是诱导重编程技术的安全性和效率低下一直是其快速进步以及广泛应用的两大障碍。阐明诱导重编程的分子机制,提高现有技术方法的效率,已经成为本领域的研究... 展开

关键词 : 维生素C 诱导重编程技术诱导多能干细胞重编程效率细胞衰老

4. Oct4和Sall4基因在小鼠体细胞重编程中的作用机制研究

[学位论文] 赵国庆广州医科大学 2020年硕士导师: 裴端卿共71页

摘要 : 诱导多能干细胞技术是指在已经分化的体细胞中同时过表达几种关键的转录因子将分化的体细胞转化为一种多能干细胞的技术。通过这个技术获得的多能性的细胞称为诱导多能干细胞(iPSCs)。目前已经发现过表达一些转录因子的组合可以使小鼠的成纤维细胞转变... 展开诱导多能干细胞技术是指在已经分化的体细胞中同时过表达几种关键的转录因子将分化的体细胞转化为一种多能干细胞的技术。通过这个技术获得的多能性的细胞称为诱导多能干细胞(iPSCs)。目前已经发现过表达一些转录因子的组合可以使小鼠的成纤维细胞转变为诱导多能干细胞。这些转录因子的组合包括最初Yamanaka等人提出的OSK体系(Oct4、Sox2、Klf4)、Buganim等人提出的SNEL体系(Sall4、Nanog、Esrrb、Lin28)、Liu等人提出的KISLG(Kdm2b、Id1、Sall4、Lrh1和Glis1)体系和Wang等人提出的7F体系(Jdp2、Kdm2b、Mkk6、Nanog、Esrrb、Glis1、Sall4)。在这些体系中，我们发现转录因子Oct4和Sall4是不可或缺的，说明这两个因子在重编程中发挥了关键性的作用。Oct4在维持胚胎干细胞的多能性和自我更新方面起到了重要的作用。Oct4在胚胎发育过程中的表达伴随着细胞的多能性。Sall4与Oct4一样在在胚胎干细胞的增殖和多能性维持方面发挥了重要的作用。在胚胎发育过程中，Sall4调控Oct4的表达，使Oct4的表达维持在内细胞团中。目前对于Sall4与Oct4在重编程中作用以及他们之间在重编程中相互关系的研究仍然比较匮乏。我们根据7F重编程体系和OSK重编程体系设计实验研究这两个基因对于重编程的影响。最后发现，Sall4和Oct4在一定的条件下在重编程中的作用可以相互替代，两个基因共同作用下使重编程的效率提高。Sall4在重编程早期促进多能性基因的表达并且激活了Cecr2基因的表达。不同的重编程体系是否采用相同的方式进行重编程一直是普遍关注的科学问题。我们通过收集并且分析了三组不同重编程体系的高通量测序数据发现不同的重编程体系在重编程的方向上有着相同的数据特征，在非重编程的方向上有着不同的数据特征。对Sall4和Oct4这两个基因和不同重编程体系的对比研究可以加深对细胞命运转变的理解。也为解决重编程的形成的诱导多能干细胞的效率和质量低下的问题提供了一些帮助，为未来诱导多能干细胞的应用打下了基础。收起

关键词 : Oct4基因 Sall4基因体细胞重编程

5. PDHA1基因敲除对KYSE450和DU145细胞代谢重编程及生物学行为的影响

[学位论文] 刘缆郑州大学 2020年博士导师: 李惠翔共144页

摘要 : 肿瘤代谢是肿瘤生物学领域最经典的研究方向之一，在癌基因和肿瘤抑制剂被发现之前半个世纪就已经出现。肿瘤代谢的研究基础是：1.肿瘤细胞的代谢与正常细胞不同；2.肿瘤细胞的代谢改变是为了适应和维持其恶性增殖的需要。与正常细胞相比，恶性肿瘤细... 展开肿瘤代谢是肿瘤生物学领域最经典的研究方向之一，在癌基因和肿瘤抑制剂被发现之前半个世纪就已经出现。肿瘤代谢的研究基础是：1.肿瘤细胞的代谢与正常细胞不同；2.肿瘤细胞的代谢改变是为了适应和维持其恶性增殖的需要。与正常细胞相比，恶性肿瘤细胞的整体代谢框架和能量代谢模式发生了显著变化，包括葡萄糖、氨基酸、脂肪酸和核苷酸代谢等方面，被称为代谢重编程(Metabolic reprogramming)。随着研究的深入，恶性肿瘤细胞的代谢改变与其恶性行为之间的联系越来越受关注，肿瘤代谢领域的研究有助于揭示肿瘤治疗的潜在靶点。氧化磷酸化和糖酵解是细胞能量代谢的主要方式。上世纪20年代，德国生物学家OttoWarburg在实验中首先发现，即便是在氧气供应充足的条件下，恶性肿瘤细胞依然偏好于利用糖酵解进行代谢，这种现象被称为“Warburg效应”或者“有氧糖酵解”。Warburg效应已被证实存在多数肿瘤类型中，是恶性肿瘤细胞的重要特征之一，也是经典的代谢重编程途径。起初，研究者们认为Warburg效应的产生原因是肿瘤细胞线粒体功能障碍，无法进行氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation, OXPHOS)。然而越来越多的研究显示，恶性肿瘤细胞的线粒体功能可保持完整，包括肿瘤干细胞在内的多种肿瘤细胞，均有活跃的氧化磷酸化功能。丙酮酸是连接胞浆糖酵解与线粒体氧化磷酸化的关键分子，是细胞代谢网络中的关键节点。丙酮酸脱氢酶E1α亚单位(Pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit，PDHA1)是丙酮酸进入线粒体后，转化为乙酰辅酶A的限速酶，将糖有氧氧化与三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle，TCA cycle)和氧化磷酸化连接起来。PDHA1的适当表达是氧化磷酸化能正常进行的重要前提条件。PDHA1表达缺失将导致细胞氧化磷酸化障碍，进而迫使细胞进行代谢重编程。目前在肿瘤代谢研究方向的共识性结论有：①Warburg效应(有氧糖酵解)是恶性肿瘤细胞的主要特征之一，它对于肿瘤恶性行为的维持起着重要作用；②某些类型肿瘤的OXPHOS功能活跃，OXPHOS有助于这些肿瘤的增殖、转移和耐药等。需要注意的是，不同肿瘤类型之间存在代谢异质性。不同组织来源的细胞受自身代谢网络局限，具有不同的代谢表型，即便是在相同条件下启动代谢重编程时，其重编程的代谢路径或代谢模式也可能存在差别。为进一步研究糖代谢(糖酵解和氧化磷酸化)重编程对不同类型肿瘤代谢框架的影响，探讨代谢重编程在肿瘤发生、发展中的作用，本研究选取两株不同组织来源的肿瘤细胞系(食管癌KYSE450细胞、前列腺癌DU145细胞)，分别利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除其氧化磷酸化关键酶PDHA1基因，建立了两株氧化磷酸化障碍的肿瘤细胞模型(KYSE450PDHA1-/-细胞、DU145PDHA1-/-细胞)，通过检测细胞模型的能量代谢变化，了解PDHA1基因敲除对肿瘤细胞糖代谢的影响；通过代谢组学分析，研究肿瘤细胞代谢重编程的改变；通过体外细胞实验以及动物成瘤实验，探讨PDHA1基因敲除对肿瘤细胞生物学行为的影响；并对代谢和生物学改变的分子机制进行分析。第一部分:PDHA1基因敲除肿瘤细胞模型的建立和鉴定研究方法: 1.使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，分别对食管癌KYSE450细胞系、前列腺癌DU145细胞系进行PDHA1基因敲除，挑选单克隆，建立稳定的PDHA1基因敲除肿瘤细胞模型作为实验组细胞(即氧化磷酸化障碍肿瘤细胞系)，对应的亲本细胞为对照组细胞。 2.分别使用免疫细胞化学、蛋白免疫印记法检测氧化磷酸化障碍肿瘤细胞系中PDHA1蛋白表达，验证基因敲除情况。 3.应用SeahorseXFe96细胞能量代谢分析仪，分别检测细胞内葡萄糖氧化磷酸化偶联的细胞耗氧量(OCR)、以及胞外糖酵解偶联的产酸能力(ECAR)，了解肿瘤细胞模型中氧化磷酸化和糖酵解情况，分析PDHA1基因敲除对细胞能量代谢的影响；检测细胞培养基中葡萄糖含量改变，了解细胞对葡萄糖消耗情况。研究结果: 1.成功构建了稳定的PDHA1基因敲除食管癌细胞和前列腺癌细胞模型，分别为KYSE450PDHA1-/-细胞和DU145PDHA1-/-细胞。 2.KYSE450PDHA1-/-细胞的氧化磷酸化被明显抑制，糖酵解显著增强，对葡萄糖消耗量也大幅增加，细胞代谢呈现为典型的Warburg效应。 3.前列腺癌DU145细胞在PDHA1基因敲除后，氧化磷酸化被抑制，但糖酵解速率无显著变化，葡萄糖消耗较亲本细胞减少，细胞能量代谢活动减弱。第二部分:肿瘤细胞模型生物学行为及成瘤能力的研究研究方法: 1.使用长时间活细胞动态成像系统(Incucyte FLR)检测细胞生长增殖；使用流式细胞术检测细胞周期。 2.使用平板细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力；划痕实验检测细胞迁移能力；Transwell小室实验检测细胞侵袭能力；使用与化疗药物共培养的平板细胞克隆形成实验，检测细胞对化疗的耐受性。 3.使用裸鼠移植瘤形成实验，观察肿瘤细胞模型在裸鼠体内成瘤能力的变化；HE染色观察移植瘤组织的病理结构。 4.使用免疫组化染色检测移植瘤中CD31蛋白表达情况，计算移植瘤微血管密度，检测诱导肿瘤血管生成能力变化。研究结果: 1.较亲本细胞而言，食管癌氧化磷酸化障碍细胞系(KYSE450PDHA1-/-细胞)生长速度明显加快，增殖能力显著增强；流式细胞周期显示，G1期细胞比例明显减少，S期细胞比例增加，细胞周期加快；克隆形成能力明显增强，细胞迁移能力增强，侵袭能力显著提高，对化疗耐受性明显增加。 2.前列腺癌氧化磷酸化障碍细胞系(DU145PDHA1-/-细胞)生长速度较亲本细胞减慢；G1期细胞比例显著增加，G2/M期细胞比例降低，提示细胞周期阻滞；克隆形成能力明显下降，细胞迁移及侵袭能力显著减弱；对化疗药物耐受性降低。 3.KYSE450PDHA1-/-细胞形成的移植瘤生长较快，体积较大，重量较重，提示成瘤能力增强；移植瘤组织HE染色显示，肿瘤细胞分化较差，形态多样，排列紊乱，恶性程度增加。 4.DU145PDHA1-/-细胞形成的移植瘤生长较慢，体积较小，重量较轻，提示成瘤能力减弱；移植瘤组织HE染色显示，肿瘤细胞体积及细胞核体积相对较小，核质比相对降低，细胞恶性程度相对减弱。 5.两株肿瘤细胞模型形成的移植瘤组织中，微血管密度均增加，提示其诱导肿瘤血管生成能力增强。第三部分PDHA1基因敲除对代谢重编程的影响研究方法 1.使用GC-TOF-MS代谢组学检测方法，筛选和鉴定PDHA1基因敲除肿瘤细胞模型与其亲本细胞间存在显著差异的代谢物；通过对差异代谢物的代谢通路富集分析，了解两组细胞间发生改变的代谢通路。 2.检测细胞培养基中谷氨酰胺含量的变化，了解细胞对谷氨酰胺消耗情况；对谷氨酰胺消耗增加的肿瘤细胞模型进行谷氨酰胺剥夺实验，通过检测细胞增殖抑制情况，验证细胞对谷氨酰胺的依赖性。 3.使用蛋白印记法，检测支链氨基酸代谢途径中关键酶的表达，了解支链氨基酸分解代谢的变化。研究结果: 1.GC-TOF-MS代谢组学检测结果显示，KYSE450PDHA1-/-细胞较其亲本细胞间，存在丰度差异的已知代谢物有51个，存在明显改变的代谢通路有9个，其中较重要差异代谢通路有：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；精氨酸和脯氨酸代谢；嘧啶代谢；柠檬酸循环(三羧酸循环)。 2.KYSE450PDHA1-/-细胞谷氨酰胺消耗量较亲本细胞显著增加；谷氨酰胺剥夺条件下，KYSE450PDHA1-/-细胞生长增殖受到明显抑制，细胞呈现谷氨酰胺依赖。支链氨基酸转移酶1(BCAT1)蛋白表达在KYSE450PDHA1-/-细胞中显著升高，提示该细胞中支链氨基酸分解代谢明显增强。 3.前列腺癌细胞代谢组学检测结果显示，DU145PDHA1-/-较其亲本细胞间有差异性代谢物67个，改变明显的代谢通路12个，其中较重要差异代谢通路有：精氨酸和脯氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。 4.DU145PDHA1-/-细胞谷氨酰胺消耗量较亲本细胞DU145显著降低；相应的剥夺谷氨酰胺培养对DU145细胞的抑制作用更强；DU145PDHA1-/-细胞BCAT1表达明显降低，提示其支链氨基酸分解代谢减弱。第四部分代谢重编程及生物学行为改变的机制研究研究方法 1.分别对KYSE450PDHA1-/-细胞、DU145PDHA1-/-细胞及其对照组细胞进行转录组学测序，检测实验组与对照组细胞的差异表达基因，分析差异表达基因相关GO及KEGG通路变化，探讨可能对细胞代谢和生物学行为产生影响的信号通路；使用RT-PCR验证测序结果的可信性。 2.使用蛋白免疫印记法分别检测P53、磷酸化P53、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、血管生成素2(ANG2)和血管内皮生长因子A(VEGFA)的蛋白表达；使用流式细胞术检测耐药基因ABCG2表面抗原的表达情况。研究结果 1.转录组学测序结果显示，KYSE450PDHA1-/-细胞与亲本细胞存在差异表达基因共2665个，以上调基因为主(1803个)；差异基因最富集的通路主要为与肿瘤相关通路、P13K-Akt信号通路及MAPK信号通路。RT-PCR检测了与肿瘤发生相关、上调最显著的9个基因，结果与测序结果一致，证实转录组结果的可信性。 2.DU145PDHA1-/-细胞与亲本细胞存在差异表达基因共2538个，以下调基因为主(1710个)；差异基因最富集的通路主要为P13K-Akt信号通路及肿瘤相关通路。 3.P13K-Akt信号通路可能参与了PDHA1基因敲除肿瘤细胞代谢重编程及肿瘤发生发展过程。 4.在KYSE450PDHA1-/-细胞中，P53及磷酸化P53蛋白表达均显著降低，提示P53低表达可能促进了Warburg效应的发生，并使细胞逃逸凋亡、获得增殖优势；葡萄糖转运蛋白1表达显著升高，增强了KYSE450PDHA1-/-细胞对葡萄糖的摄取能力，有利于糖代谢过程；耐药基因ABCG2表面抗原表达升高，提示ABCG2参与了细胞对化疗药物的耐受。 5.KYSE450PDHA1-/-细胞的ANG2及VEGFA表达均显著升高，提示其参与了KYSE450PDHA1-/-细胞诱导的肿瘤血管生成；而DU145PDHA1-/-细胞中ANG2及VEGFA表达均无增加，提示OXPHOS障碍肿瘤细胞系诱导血管生成的分子机制并不相同。研究结论: 1.敲除食管癌KYSE450细胞和前列腺癌DU145细胞的有氧氧化关键酶PDHA1基因，均可抑制细胞氧化磷酸化，构建氧化磷酸化障碍肿瘤细胞模型。 2.KYSE450PDHA1-/-细胞发生糖代谢重编程，糖酵解代谢显著增强，葡萄糖消耗明显增加，呈现典型的Warburg效应；同时细胞对谷氨酰胺依赖性增强，支链氨基酸代谢活跃；在生物学行为改变方面，细胞增殖、侵袭、迁移能力和化疗耐受性均提高，细胞恶性程度显著增强。 3.DU145PDHA1-/-细胞在氧化磷酸化被阻断后，糖酵解并无明显增强，葡萄糖消耗减少，糖代谢减弱；细胞对谷氨酰胺消耗减少，支链氨基酸代谢减弱；同时细胞的增殖、侵袭和迁移能力减弱，对化疗更加敏感，恶性程度明显降低。 4.PI3K-Akt信号通路可能参与了PDHA1基因敲除肿瘤细胞增殖和代谢重编程的调控。收起

关键词 : 肿瘤代谢 KYSE450细胞代谢重编程 DU145细胞代谢重编程 PDHA1基因基因敲除生物学行为

6. 典型物联网系统的空中下载方法研究

[学位论文] 周培锋合肥工业大学 2014年硕士导师: 韩江洪共67页

摘要 : 物联网系统的更新成为物联网广泛应用后的一个突出难题,人工到达安装现场逐个对节点进行更新的传统手段不仅耗费大量的人力与物力,而且是不切实际的,一种远程自动的、支持范围选择的更新手段成为迫切的需求。本文以采用三层体系架构的典型物联网... 展开

关键词 : 物联网空中下载重编程能量均衡

7. ATP4B表达异常通过调控p53/SCO2通路影响胃黏膜细胞能量代谢和癌变进程

[学位论文] 李扬杰南方医科大学 2022年硕士导师: 王继恒共64页

摘要 : 研究目的和背景胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内仍有较高的发病率和死亡率。H+-K+-ATP酶β亚基(ATP4B)特异性分布在胃黏膜壁细胞的分泌小管膜上，被认为是胃的功能基因。研究显示胃癌组织中ATP4B基因表达较正常胃粘膜组织明显... 展开研究目的和背景胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内仍有较高的发病率和死亡率。H+-K+-ATP酶β亚基(ATP4B)特异性分布在胃黏膜壁细胞的分泌小管膜上，被认为是胃的功能基因。研究显示胃癌组织中ATP4B基因表达较正常胃粘膜组织明显下调，其表达异常可能与胃癌的不良预后相关。课题组前期发现在胃癌细胞中恢复ATP4B可发挥抑癌作用，但对其机制缺乏系统研究。本研究将通过干扰或恢复ATP4B进一步研究其参与调控胃癌发生发展的机制。研究方法 1、通过基因表达谱交互分析数据库和人类蛋白免疫组化表达数据库探究胃癌组织及胃粘膜组织ATP4B表达差异。 2.通过免疫组织化学染色评估临床胃癌组织ATP4B表达水平，分析ATP4B表达变化与胃癌组织病理学特征及患者预后之间的关系。 3.通过WesternBlot验证胃正常粘膜上皮细胞株及癌细胞株中ATP4B的表达差异;恢复胃癌细胞株MGC803的ATP4B表达水平，通过CCK-8实验、划痕实验、Transwell实验及TUNEL实验检测ATP4B过表达对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡等生物学行为的影响。同时，构建干扰ATP4B表达的siRNA，在GES-1和AGS细胞株中进行siATP4B转染实验，重复上述细胞表型实验探究其对高表达ATP4B细胞株生物学行为的影响。 4.通过Cytoscape及R等生物信息学软件对ATP4B调控的差异蛋白进行生物学功能及通路聚类分析，并通过WesternBlot、RT-qPCR、线粒体功能检测、细胞表型等实验探究ATP4B调控细胞能量代谢和癌变的潜在机制。结果 1.ATP4B基因在胃癌组织和相关细胞系中普遍低表达，与肿瘤低分化状态、淋巴结转移、TNM分期密切相关;组织ATP4B的表达与胃癌患者总体生存率正相关。 2.恢复胃癌细胞内ATP4B的表达可以促进胃癌细胞凋亡、抑制增殖、迁移和侵袭，而干扰ATP4B表达可促进胃癌细胞的恶性生物学行为。 3.基因功能注释分析富集分析显示ATP4B调控的下游差异蛋白主要参与调控线粒体功能和能量代谢。KEGG通路分析提示差异蛋白主要富集在细胞能量代谢和p53通路上。ATP4B可作为抑癌基因参与胃黏膜癌变，恢复胃癌细胞ATP4B的表达可通过激活p53通路影响胃癌细胞的增殖和凋亡活性。同时恢复胃癌细胞内ATP4B表达可使ATP和乳酸生成降低、ROS产生增加，而恢复ATP4B表达同时敲低p53基因的表达则会使ATP、乳酸生成较ATP4B过表达组增多，而ROS生成相对较少。RT-PCR和WesternBlot结果提示ATP4B的表达可通过激活p53/SCO2通路参与调控胃癌细胞能量代谢和癌变进程。结论 ATP4B基因在胃癌组织和细胞中表达明显下调，与胃癌患者低生存率显著相关，有望成为胃癌患者潜在的预后标志物。ATP4B表达异常可通过p53/SCO2通路调控胃粘膜细胞能量代谢和癌变进程。收起

关键词 : 胃癌 ATP4B p53 代谢重编程线粒体

8. 肿瘤细胞来源的诱导多能干细胞研究

[学位论文] 秦鼎新北京协和医学院(中国医学科学院) 2010年博士导师: 李利民共52页

摘要 : 诱导型多能性干细胞（Induced Pluripotent Stem Cell，iPS cell）是一种人工诱导获得的多功能的干细胞，可以由各种终端分化细胞诱导表达一系列特定因子生成。由于使用胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ES cell）进行科学研究和医学治疗面临人类伦理... 展开

关键词 : 肿瘤细胞 iPS细胞诱导重编程

9. 牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录因子GATA4的功能探究

[学位论文] 刘秀梅中国海洋大学 2018年博士导师: 张全启共141页

摘要 : 转录因子在细胞生长与分化、胚胎发育和器官形态发生等生物学过程中起着非常重要的调节作用，因此也一直受到研究者的广泛关注。长期以来，对高等脊椎动物转录因子的研究相对较为深入，而对鱼类等低等脊椎动物转录因子的研究则十分有限。GATA4属于GAT... 展开转录因子在细胞生长与分化、胚胎发育和器官形态发生等生物学过程中起着非常重要的调节作用，因此也一直受到研究者的广泛关注。长期以来，对高等脊椎动物转录因子的研究相对较为深入，而对鱼类等低等脊椎动物转录因子的研究则十分有限。GATA4属于GATA家族，是一种重要的转录因子。已有研究证实，哺乳动物GATA4在性别分化和细胞重编程过程中扮演着重要的角色。而关于非哺乳类脊椎动物（尤其是海水硬骨鱼类）GATA4的研究，则仅停留在对其基因的鉴定与表达模式分析等层面。本论文中，我们不但鉴定获得了牙鲆（Paralichthysolivaceus）的gata4基因，探究其mRNA水平的表达模式；同时还利用生物信息学方法在牙鲆全基因组范围内预测得到GATA4的一系列靶基因，并挑选其中与性别分化和细胞重编程相关的成员对其功能进行了验证分析。哺乳动物中GATA6作为GATA4/5/6亚家族的成员之一，与GATA4功能相似，均在性别分化过程中发挥着重要的调节作用。因此本论文中我们还同时鉴定获得了牙鲆gata6基因，并对其二者在激素处理后的表达模式进行了探究。通过RACE等技术，我们首先鉴定得到了牙鲆gata4基因的全长cDNA序列，这其中包括130bp的5’-UTR区、1176bp的ORF区和364bp的3’-UTR区。基因结构分析显示gata4基因含有6个外显子和5个内含子，与大部分脊椎动物gata4的基因结构组成一致。同源氨基酸序列比对发现，牙鲆与其它脊椎动物GATA4的序列一致度较高，并且都包含两个保守的锌指结构域。对牙鲆gata4基因在胚胎发育时期的表达模式分析显示，其早期痕量表达，自囊胚期开始其表达量显著上升。而对其在不同组织中的表达模式分析则发现，该基因在性腺中的表达呈现性别二态性，即精巢中的表达量显著高于卵巢。之后进行的性腺亚细胞定位分析结果显示，牙鲆gata4基因在精巢中仅分布于精原细胞和支持细胞，在卵巢中则分布于卵原细胞和卵母细胞。接下来，为了进一步探究牙鲆GATA4的功能，我们先使用perl语言和生物信息学的方法批量获得了牙鲆所有基因的启动子序列，然后使用Genomatix的MatInspector软件对获得的所有启动子序列进行了批量化的GATA4转录因子结合位点预测。最终我们共获得牙鲆GATA4靶基因116个，其中有与心血管系统相关的MsrA等，与神经系统相关的Atxn1等，与离子通道相关的Chrna7等，与生殖系统相关的R-spondin1等，以及与维持细胞多能性相关的Sox2等。随后，我们分别选取与性别分化相关的R-spondin1基因以及与诱导细胞重编程相关的Sox2基因对其进行了实验验证。DNA-蛋白质相互作用的半定量结合实验结果显示，GATA4蛋白能够与牙鲆R-spondin1和Sox2基因的启动子序列结合。而双荧光素酶报告系统实验结果则进一步表明，GATA4能够增加牙鲆R-spondin1和Sox2基因启动子的活性，同时GATA4的过表达能够上调卵巢原代细胞和下丘脑细胞系（FBCs）中R-spondin1和Sox2基因的表达。上述结果均证明牙鲆GATA4对R-spondin1和Sox2基因具有一定的调控作用。脊椎动物GATA4和GATA6均能参与类固醇激素的合成，同时其二者的表达又都受到激素水平的调控。因此为了探究牙鲆gata4和gata6基因在激素处理后的表达模式，我们又对牙鲆gata6基因的全长cDNA序列进行了鉴定，该序列包括92bp的5’-UTR区、1608bp的ORF区和257bp的3’-UTR区。经后续实验我们发现，牙鲆gata6和gata4的表达模式基本一致，胚胎发育过程中均自囊胚期开始表达量显著上升，且在精巢中的表达量显著高于卵巢。而其二者在性腺中的亚细胞定位结果却存在差异，gata6仅在精巢的支持细胞和卵巢的卵母细胞中表达。最终我们又通过qRT-PCR的方法检测了其二者对激素的响应，结果表明，激素处理后的牙鲆性腺细胞和成鱼性腺中gata4和gata6具有非常相似的应答模式。因此我们有理由相信，gata4和gata6在牙鲆性别分化过程中发挥着相似的调节作用。综上所述，本论文通过对牙鲆gata4基因的鉴定、表达模式分析和靶基因的验证，推断其可能通过对R-spondin1和Sox2基因的调控而参与牙鲆的性别分化和细胞重编程过程；此外，结合激素处理后牙鲆gata4和gata6的表达模式探究，我们推断其二者在牙鲆性别分化过程中发挥了相似的调节作用。本论文为牙鲆乃至其它硬骨鱼类的生殖和发育研究提供了一定的参考依据，为种质资源的保存和利用提供了有益的参考，同时也为鱼类育种工作的进一步开展奠定了理论基础。收起

关键词 : 牙鲆 GATA4 靶基因性别分化细胞重编程

10. LncRNA Rslnr1调控干细胞多能性及重编程作用和机制的研究

[学位论文] 韩真真吉林大学 2022年博士导师: 李薇共131页

摘要 : 研究目的：在干细胞研究最开始进入人们视野的时候，并未在医学界引起广泛关注。直到1997年，克隆羊多利出现后，干细胞领域才成功引起了全世界的关注。但是胚胎干细胞的来源存在着伦理学问题，如果用人类胚胎干细胞来做研究，有人认为这是对生... 展开研究目的：在干细胞研究最开始进入人们视野的时候，并未在医学界引起广泛关注。直到1997年，克隆羊多利出现后，干细胞领域才成功引起了全世界的关注。但是胚胎干细胞的来源存在着伦理学问题，如果用人类胚胎干细胞来做研究，有人认为这是对生命的漠视，会导致一系列社会问题，因此干细胞研究也进入了瓶颈期。直到2006年，日本学者Yamanaka等首次将转录因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc, OSKM）导入到已经分化的体细胞中，并将其逆转为诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）。iPSCs的出现解决了胚胎干细胞来源的伦理学问题，但是重编程产生iPSCs的效率低下，这也限制了其在再生医学领域的应用。自iPSCs发现的十几年间，人们都在致力于探索重编程的机制以及如何提高重编程效率。研究发现，加入一些小分子化合物如维生素C等能促进重编程。加入一些新的转录调控因子如各种蛋白质和 RNA，能够影响一些重要信号通路，调控表观修饰来提高重编程的效率。长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）可以调控细胞的不同生物进程，过去的研究表明lncRNA可以调控启动子和增强子形成的染色质环空间结构、组蛋白修饰和DNA甲基化等过程，在干细胞的多能维持及重编程过程中起到重要作用。但这些lncRNA对干细胞命运的调控主要表现在转录水平，有关于lncRNA对干细胞翻译水平调控的研究并不多。干细胞增殖速度很快，需要很高的翻译效率来维持其活跃的多能性状态，抑制干细胞的翻译，会导致一些重要的不稳定蛋白如Nanog等干性因子表达减少，从而导致细胞分化，因此在翻译水平的调控对干细胞命运也至关重要。有研究报道lncRNA可以与核糖体结合，这提示了lncRNA可能在翻译水平调控干细胞命运。本研究为了寻找可能与翻译相关的多能lncRNA，我们提取不同细胞核糖体多聚体的RNA，并利用RNA-Seq技术筛选出在胚胎干细胞E14中高表达的一条新lncRNA，将其命名为ribosome-associated lncRNA1，简称Rslnr1。我们推测Rslnr1可能在翻译水平调控干细胞多能性，从而促进多能性状态维持及重编程进程，我们需要进行一系列的研究来确定Rslnr1的表达、定位、功能、以及作用机制。我们拟通过本研究提出“lncRNA能够通过影响翻译过程来调节干细胞多能性”这一新的研究思路，深入探索重编程机制。研究方法： 1．利用蔗糖梯度离心的方法提取核糖体，并绘制polysome profiling曲线，提取多聚体RNA进行RNA-Seq，筛选出在干细胞内高表达的lncRNA Rslnr1。 2．应用PCR或者实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR, RT-qPCR, qPCR）验证Rslnr1在干细胞、成纤维细胞以及其它分化的组织器官中的表达；明确Rslnr1在拟胚体分化过程中的表达变化。 3．利用胞浆胞核分离技术和RNA荧光原位杂交实验（FISH）来确定Rslnr1的亚细胞定位；进一步利用qPCR确认Rslnr1在不同密度核糖体的分布。 4．构建 Rslnr1敲低载体并将其转入干细胞内，用蛋白免疫印迹（western blotting, WB）和qPCR检测干性基因的表达变化，同时通过克隆形成实验和CCK8增殖实验检测干细胞增殖能力是否下降。 5．构建Rslnr1过表达载体，并在重编程过程中设置过表达组（Rslnr1-OE）、随机对照组（CT-OE）和空白对照组（Vector）。通过qPCR检测不同组间干性基因表达差异；通过Nanog免疫荧光染色观察不同组Nanog阳性的iPSCs克隆数目差异；通过碱性磷酸酶染色判断Rslnr1是否能促进重编程。 6．在成纤维细胞中过表达Rslnr1，观察其对干性基因的影响。 7．用SunSet（Surface sensing of translation）方法检测敲低Rslnr1对总体蛋白合成效率的影响。 8．使用“polysome shift”的方法检测在 Rslnr1敲低后特定干性基因的翻译效率是否发生改变。 9．通过RNA pull-down实验和蛋白质谱分析，寻找与Rslnr1相互作用的蛋白。 10．利用RNA免疫沉淀（RIP）方法进一步验证eIF4G1和Rslnr1的结合。研究结果： 1．Rslnr1是一条位于X染色体上的长度为479 bp的新的lncRNA。 2．Rslnr1在干细胞内特异性高表达，在成纤维细胞及其它分化的组织器官中不表达或者低表达；Rslnr1的表达随拟胚体分化逐渐下调，其下调趋势和干性因子一致。 3．Rslnr1主要定位在细胞质内；Rslnr1不仅在核糖体多聚体内表达，在单聚体内也有表达。 4．干细胞内敲低Rslnr1导致干性标志物Oct4、Sox2和Nanog的mRNA和蛋白水平表达均下调；且细胞克隆形成能力和增殖能力减弱。 5．在重编程中，Rslnr1过表达组的干性基因表达、Nanog免疫荧光染色阳性的iPSCs克隆数以及碱性磷酸酶染色都强于对照组，Rslnr1促进重编程。 6．成纤维细胞中过表达Rslnr1对其干性基因表达并没有明显影响。 7．用Sunset方法证明敲低Rslnr1后总体蛋白合成效率下降。 8．敲低Rslnr1后使用“polysome shift”发现Sox2 mRNA由翻译效率较高的“heavy polysome”向翻译效率较低的“light polysome”移动，Sox2蛋白合成效率降低。 9．Rslnr1进行RNA pull-down及质谱分析结果显示与Rslnr1结合的蛋白富集到了与核糖体合成和翻译相关的通路，Rslnr1可能和多个翻译起始因子例如eIF4G1结合。 10.使用RIP-qPCR检测到Rslnr1确实能够和eIF4G1结合。研究结论： 1．LncRNA Rslnr1是从核糖体内提取的RNA，主要位于细胞质内，在小鼠胚胎干细胞 E14中高表达，在小鼠成纤维细胞以及其他组织器官不表达或者低表达，随细胞分化减少。 2．LncRNA Rslnr1对干细胞多能性维持至关重要，敲低Rslnr1导致细胞分化；且其对重编程有促进作用，能够提高重编程效率。 3．LncRNA Rslnr1对干细胞的翻译起到调控作用，敲低Rslnr1后干细胞总体蛋白合成速度下降，且Sox2翻译效率也下降。LncRNA Rslnr1通过与eIF4G1互作来发挥作用。收起

关键词 : 干细胞长链非编码RNA 重编程进程多能性