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[学位论文] 董明珠中国科学院大学 2012年博士导师: 周琪共86页

摘要 : 啮齿类动物的胚胎干细胞(ESCs)与上胚层干细胞(EpiSCs)是建系来源不同的两大多能性干细胞。啮齿类动物的胚胎干细胞主要依靠LIF和BMP4来维持多能性状态，其具有体内外分化成三胚层细胞的能力;啮齿类动物的胚胎干细胞可以通过二倍体嵌合参与胚胎发育过... 展开啮齿类动物的胚胎干细胞(ESCs)与上胚层干细胞(EpiSCs)是建系来源不同的两大多能性干细胞。啮齿类动物的胚胎干细胞主要依靠LIF和BMP4来维持多能性状态，其具有体内外分化成三胚层细胞的能力;啮齿类动物的胚胎干细胞可以通过二倍体嵌合参与胚胎发育过程，又可以通过四倍体补偿获得可育的动物后代。啮齿类动物上胚层干细胞则依靠Activin/Nodal和bFGF-ERK维持其未分化的状态，其具有体内外分化得到三胚层细胞的能力，但不能参与正常的胚胎发育过程。在生物学特性方面，啮齿类动物上胚层干细胞与人胚胎干细胞表现出相似的特征。本论文着重阐述了以下几个问题:(1)如何建立稳定的啮齿类动物上胚层干细胞系;(2)上胚层干细胞与胚胎干细胞是否能够相互转化;(3)上胚层能否建立单倍体细胞系。首先，我们建立了符合标准的小鼠上胚层干细胞系，表现在:(1)细胞集落的形态为单层扁平状;(2)碱性磷酸酶染色为阴性;(3)表达多能性基因Oct4、Nanog，及上胚层特异的标记分子;(5)能够形成拟胚体，能够分化成三胚层来源的各种细胞类型;(6)能够形成畸胎瘤;(7)雌性细胞系，其中一条X染色体处于失活状态;(8)不能够形成嵌合鼠等。同时，我们还尝试建立大鼠上胚层干细胞系，将其在体外培养了3代。其次，小鼠ESCs在EpiSC培养体系下可分化形成小鼠EpiSCs。相应地，通过EpiSC培养体系直接转换为小鼠ESC培养体系的方法，我们可以实现小鼠EpiSCs向小鼠ESC状态的转化;在含有20％ Knockout血清的小鼠ESC培养体系下，比在含有15％胎牛血清的小鼠ESC培养体系下，EpiSCs向ESCs转化的效率会显著性升高;EpiSCs转化得到的reverted ESCs符合ESC的鉴定标准，如reverted ESCs表达多能性标记基因Oct4、Nanog，及ESC特异标记分子Rex1，不表达EpiSC特异标记分子Cer1;碱性磷酸酶染色为阳性;具有二倍体嵌合和四倍体补偿能力等。最后，通过单精注射到去核的卵母细胞构建单倍体胚胎的方法，我们在体外建立了单倍体胚胎干细胞系;在体外培养中，单倍体胚胎干细胞需要通过流式分选单倍体的方法维持单倍体状态;与二倍体胚胎干细胞一样，孤雄单倍体胚胎干细胞同样具有多能性;为了验证处于EpiSC状态的多能性干细胞是否可以建立单倍体干细胞系，我们将孤雄单倍体胚胎干细胞在EpiSC体系下体外诱导分化，最终得到了2株单倍体上胚层干细胞系;这两株单倍体上胚层干细胞都符合上胚层干细胞鉴定的所有标准;为了研究上胚层干细胞进一步分化后，其单倍体状态是否可以维持，我们将单倍体上胚层干细胞做神经分化，最终得到了Nestin阳性的单倍体神经样细胞，证明了上胚层干细胞分化早期的细胞可以存在单倍体。综上，我们建立了符合标准的小鼠上胚层干细胞系;通过培养体系的转换，我们能够将小鼠胚胎干细胞与上胚层干细胞进行体外相互转化;建立了单倍体上胚层干细胞系，证明了上胚层仍然存在单倍体，推动了单倍体细胞维持机制的研究工作。收起

关键词 : 上胚层干细胞胚胎干细胞单倍体重编程多能性啮齿类动物

2. 南方红豆杉中产漆酶的特异性内生真菌分离、鉴定及其初步应用研究

[学位论文] 董明珠北京林业大学 2020年硕士导师: 付玉杰共68页

摘要 : 森林资源可持续开发利用是林业产业发展的重要任务之一。森林植物作为宿主，寄生着多种附生或内生的微生物，其中森林植物的内生真菌由于其代谢物对森林植物的生长发育和抗性提高有着重要的作用，特异性植物内生真菌的筛选和应用具有重要的研究价值。... 展开森林资源可持续开发利用是林业产业发展的重要任务之一。森林植物作为宿主，寄生着多种附生或内生的微生物，其中森林植物的内生真菌由于其代谢物对森林植物的生长发育和抗性提高有着重要的作用，特异性植物内生真菌的筛选和应用具有重要的研究价值。本文以筛选产漆酶的南方红豆杉植物内生真菌为目的，从南方红豆杉的根、茎、叶中分离、纯化得到了58株内生真菌，从中筛选出了一株具有漆酶活性的内生真菌N-31，并对其进行了形态学和分子生物学鉴定，以漆酶活性为评价指标，优化了N-31的培养基碳源、氮源、发酵温度、发酵时间、培养基初始pH。最后对南方红豆杉源真菌漆酶N-31的生化特性和基础应用进行了初步研究。主要研究结果如下： 1.从南方红豆杉的根、茎、叶中分别筛选出内生真菌37株、9株和12株，总计58株。对这些内生真菌进行统计，大部分属于拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)，茎点霉属(Phoma)，镰刀菌属(Fusarium)，短柄霉属(Aureobasidium)和链格孢属(Alternaria)。为了获得具有漆酶活性的真菌，采用了愈创木酚平板显色法对分离出的58株真菌进行筛选，经鉴定为Paraboeremiaselaginellae的菌株被认为是漆酶的产生菌。 2.通过单因素和响应面实验优化了产漆酶的南方红豆杉源内生真菌N-31的最佳培养基和发酵条件：2%的葡萄糖为碳源，1%牛肉膏为氮源，发酵温度为27℃，发酵时间为4d，培养基初始pH为4.6，在最佳条件下进行漆酶的发酵所获得的漆酶酶活可达到105.58U/L。 3.对内生真菌N-31产漆酶的酶学性质及初步应用进行研究。当pH范围处于酸性，漆酶的酶活普遍较高，pH为3时酶活达到最大值，在pH为4时漆酶的稳定性最好。该漆酶的最适温度为40℃，当温度小于30℃时热稳定性最好。用漆酶辅助提取五味子果中的活性成分，用漆酶预处理后的五味子果后，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素六种活性成分的提取率分别提高了13.63%，18.73%，14.48%，16.18%，24.62%和22.55%。同时漆酶对抗生素磺胺甲恶唑具有一定的降解效果，在7小时内漆酶对初始浓度为10μg/L、20μg/L和40μg/L的磺胺甲恶唑溶液的降解率分别为69.04%、58.27%和37.80%。本文从南方红豆杉中分离筛选出一株特异性产漆酶内生真菌N-31，所产漆酶具有良好的生化特性，并具有生物转化辅助提取和抗生素生物降解能力，为南方红豆杉源内生真菌产漆酶的应用提供了科学基础。收起

关键词 : 南方红豆杉漆酶内生真菌生物转化抗生素降解