中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 王莉石河子大学 2018年硕士导师: 张惠荣共50页

摘要 : 背景和目的：德朗热综合征（Cornelia de Lange Syndrome，CdLS）是一个由基因突变造成的罕见的伴有严重的生长发育缺陷和累及多器官系统的先天性遗传性疾病。这些基因的突变会引起基因表达的失调，并伴有多种严重的骨发育异常，主要表现为生长... 展开背景和目的：德朗热综合征（Cornelia de Lange Syndrome，CdLS）是一个由基因突变造成的罕见的伴有严重的生长发育缺陷和累及多器官系统的先天性遗传性疾病。这些基因的突变会引起基因表达的失调，并伴有多种严重的骨发育异常，主要表现为生长智能迟滞、认知障碍、上肢畸形、多毛症、特殊面容、心脏瓣膜缺陷等多器官功能异常，严重影响了新生儿及儿童的健康成长，给家庭和社会造成了沉重的负担。其中，该病65%的患儿是由NIPBL、Smc1和Smc3这三个基因突变所导致，NIPBL基因突变是引起常染色体显性遗传性疾病德朗热综合征的主要病因，约60%的患儿由NIPBL基因突变引起。在胎鼠的肢芽发育阶段中，NIPBL基因对位于肢芽ZPA（Zone of Polarizing Activity）区域的Shh（Sonic Hedgehog）基因具有调控作用，影响Shh基因的表达，但具体两个基因之间的交互作用如何以及规律如何，还未可知。本实验，我们利用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建立NIPBL+/-基因剔除小鼠模型，在此模型的基础上，探讨Shh基因在胎鼠发育的不同时期的表达情况。方法： NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠的背景品系小鼠是C57BL/6J,SPF级，购于浙江大学，全部小鼠饲养于石河子大学药学院实验动物中心。实验过程遵照石河子大学动物实验伦理委员会管理条例。本实验，我们首先建立NIPBL-Loxp小鼠模型，然后再利用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建立NIPBL+/-基因剔除小鼠模型，然后NIPBL+/-小鼠模型作为亲代鼠，挑选NIPBL+/-小鼠雄性35g左右，雌性30g左右，在晚上20:00点将雌、雄小鼠按2:1合笼，次日早上8点检查雌鼠的阴栓，将阴栓阳性者的雌鼠次日中午作为其胚胎E0.5天。经过相互杂交NIPBL+/-小鼠模型，在孕鼠的E10、E11、E12天，取出孕鼠放在超净台内，用颈部脱臼法处死孕鼠，在严格的无菌操作条件下，取出胎鼠。胎鼠被取出后，分别采用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技术鉴定得到6只NIPBL+/-胎鼠的肢芽作为实验组，和6只NIPBL+/+胎鼠的肢芽作为对照组，然后分离胎鼠的四肢，放入液氮和-80℃冰箱备用；最后采用定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术分别检测实验组和对照组胎鼠肢芽内Shh基因的表达情况。结果：用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建立NIPBL+/-基因剔除小鼠模型，NIPBL+/-小鼠相互杂交通过RT-PCR技术鉴定出作为实验组和对照组的胎鼠。其中，实验组和对照组胎鼠肢芽内的Shh基因在E10、11、12天均有表达，而且实验组和对照组胎鼠肢芽内的Shh基因在E10天的ΔCt值>E12天的ΔCt值>E11天的ΔCt值（ΔCt值越高，Shh基因的表达水平越低），表明在不同的孕期（E10、11、12天）天数下相比较，实验组和对照组胎鼠肢芽内Shh基因表达趋势是先升后降，差异有统计学意义(P<0.01)；在相同的孕期(E10、11、12天）天数内，实验组Shh基因的ΔCt值大于对照组ΔCt值，表明实验组胎鼠肢芽内Shh基因的表达水平低于对照组，这种差异也有统计学意义(P<0.01)。结论：在孕鼠的E10、E11、E12天，NIPBL+/-基因剔除的胎鼠抑制其肢芽内Shh基因的表达，说明Shh基因在胎鼠肢芽发育中的特定时期进行表达，有助于人们更好地了解德朗热综合征中骨骼畸形的发病机制。收起

关键词 : 儿童患者德朗热综合征 NIPBL基因 Shh基因肢芽ZPA

2. Shh与Wnt5a基因在NIPBL+/-小鼠模型肢芽的表达研究

[学位论文] 邢蓬蕊石河子大学 2019年硕士导师: 张惠荣共45页

摘要 : 目的：CorneliadeLange综合征（Cdls）为基因缺陷性疾病，多认为NIPBL基因突变可引起Cdls。NIPBL基因的突变可能对其调控的相关Shh、Wnt5a基因转录发生变化，从而对Wnt信号通路中关键因子功能产生影响，从而改变了成骨细胞的分化的方向等，最终导致长... 展开目的：CorneliadeLange综合征（Cdls）为基因缺陷性疾病，多认为NIPBL基因突变可引起Cdls。NIPBL基因的突变可能对其调控的相关Shh、Wnt5a基因转录发生变化，从而对Wnt信号通路中关键因子功能产生影响，从而改变了成骨细胞的分化的方向等，最终导致长骨发育异常。因此，本研究以小鼠胚胎肢芽组织为研究对象，研究Shh、Wnt5a基因在NIPBL基因缺陷小鼠肢芽的表达情况，揭示Wnt信号通路相关因子在NIPBL+/-基因敲除小鼠中的作用，探讨两个基因与Cdls综合征的关系，从而为Cdls综合征的发病机制提供相关理论依据。方法：选择实验动物为NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠的背景品系小鼠，57BL/6J，SPF级，购于浙江大学动物实验中心，动物饲养于石河子大学药学院动物实验中心，饲养条件平均温度25℃，湿度40%左右。NIPBL+/-小鼠，雄性体重35g，雌性体重30g，20：00时将雌雄小鼠按2∶1合笼，晨8:00检查雌鼠的阴栓，阳性阴栓小鼠当天12:00作为其胚胎0.5天。分别于胚胎10天、11天、12天取胎鼠进行实验验证。实验组，利用RT-PCR逆转录试剂盒鉴定后，可得到36只NIPBL+/-胎鼠肢芽，10天（n=12）、11天（n=12）、12天（n=12）。对照组，利用RT-PCR逆转录试剂盒鉴定，可得到36只NIPBL+/+胎鼠肢芽，10天（n=12）、11天（n=12）、12天（n=12），将胎鼠肢芽组织放入液氮中，15-20min后，取出肢芽组织将其冷冻保存于-80℃冰箱内，备用。real-timePCR检测Shh、Wnt5a基因转录及表达水平。实验数据均为正态分布，均数±标准差（-用单因素方差分析，且各组数据间Pearson相关分析，P＜0.05有统计学差异，P＜0.01有显著差异。(x)±s）表示，经SPSS17.0统计软件分析，各组比较均采结果：通过NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠获得NIPBL+/-小鼠模型，然后NIPBL+/-小鼠杂交，通过RT-PCR鉴定出实验组胎鼠及对照组胎鼠。利用real-timePCR检测Shh、Wnt5a基因转录水平，实验组Shh、Wnt5a的表达术后第10d开始升高，第11d达到最大值，第12d有下降。实验组各时间点与对照组各时间点比较，基因表达量较对照组表达量低，差异有统计学意义（P＜0.01），组内各不同时间段之间比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）。利用Westernblot检测Shh、Wnt5a蛋白表达水平，实验组Shh、Wnt5a的表达术后第10d开始升高，第11d达到最大值，第12d有下降，实验组各时间点与对照组各时间点比较，基因表达量较对照组表达量低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：通过检测NIPBL+/-基因敲除胎鼠肢芽中Shh及Wnt5a基因的表达发现在孕鼠第10、11、12天两基因表达受到抑制，说明NIPBL对Wnt5a和Shh基因表达有影响，有助于人们更好的了解NIPBL+/-基因缺陷引起CdLs综合征骨畸形的发病机制。收起

关键词 : 基因缺陷性疾病 Shh基因 Wnt5a基因 NIPBL+/-动物模型肢芽表达

3. 德朗热综合征表型与基因型分析及NIPBL致生长迟缓机制探讨

[学位论文] 刘晨山东大学 2023年博士导师: 盖中涛共172页

摘要 : 目的： Cornelia de Lange 综合征(CdLS,OMIM:122470,300590,300882,610759 和614701)以颅面部异常、肢体畸形、生长迟缓和智力低下为特征的遗传异质性疾病，其患病率约为1.6～2.2/10万，现有研究表明患病率没有种族差异。遗传学研究已将CdLS的病... 展开目的： Cornelia de Lange 综合征(CdLS,OMIM:122470,300590,300882,610759 和614701)以颅面部异常、肢体畸形、生长迟缓和智力低下为特征的遗传异质性疾病，其患病率约为1.6～2.2/10万，现有研究表明患病率没有种族差异。遗传学研究已将CdLS的病因归结为黏连蛋白复合体基因变异。目前已鉴定出7个与CdLS相关的基因，其中最常见的基因为NIPBL，本研究以12例经临床、分子遗传学诊断的CdLS病例为研究对象，目的在于分析其临床和遗传学特征，病人特点包括新生儿期、婴儿期、幼儿期和青春期，阐述NIPBL基因型和表型的关系;并首次建立的5个CdLS个体的iPS细胞模型，并基于iPSC进行NIPBL基因变异致CdLS生长迟缓的作用机制研究。方法： 1.收集出生史、孕产史、临床表现(包括生长发育、颅面部特点、器官畸形)及实验室检查的数据，并随访该病个性化的治疗方案。 2.对疑似患者进行全外显子组测序和Sanger测序以验证，同时借助数据库数据，对中国已报道的基因变异位点和临床表现进行对比分析。 3.分离CdLS患儿的外周血单个核细胞PBMC,采用质粒电转技术将CdLS患儿血液细胞重编程为iPS细胞。采用qRT-PCR技术检测细胞内源性干细胞标记物TRA-60、TRA-81、OCT4、SSEA4和NANOG的表达;免疫荧光技术检测细胞表面标志物TRA-60、TRA-81、OCT4、SSEA4和NANOG;iPS细胞三胚层标志物的表达是通过拟胚体分化实验完成，从而验证其多向分化潜能;采用G显带染色体核型分析iPS细胞的核型是否异常;Sanger测序技术确认所构建的iPSC携带对应的NIPBL基因变异位点。 4.正常培养传代，4例NIPBL变异的CdLS患儿的iPSC及相应年龄性别对照的正常iPSC,观察细胞的增殖情况。采用CCK8增殖检测试剂盒检测病例与对照的细胞存活率差异，采用流式细胞术检测两组细胞周期差异。 5.利用qRT-PCR技术检测病例组与对照组NIPBL、CCND1基因表达差异;利用免疫荧光技术检测NIPBL、CCND1胞内分布的变化;利用western blot技术检测两组间NIPBL、CCND1蛋白水平差异。 6.利用Wnt信号的激动剂LiCl干预细胞，观察对细胞增殖、细胞周期及CCND1表达的影响。结果： 1.临床表型:12例病例其临床表征根据国际公识的平均分为13.8±1.7分，病人男女比例1∶1;宫内发育迟缓为10/12(83.33％),生后发育迟缓为11/12(91.67％),存在连眉/浓眉、长和/或平滑的人中、长睫毛、高腭弓、小下颌全面发育迟缓/智力障碍、小头畸形、小手、隐睾，占比为100％。生长激素激发实验3人，均诊断生长激素缺乏症，病人4和病人7应用生长激素(GH)治疗提高生长速度，病人11存在低促性腺激素性性腺功能减退症。 2.从颅面部特征来看，NIPBL变异型平均得分高于其他基因变异型，从主要特征评分、身高偏离正常身高的程度、疾病的严重程度来比较，NIPBL的无义、移码的致病性变异比错义、剪接的致病性变异所致表型更严重。 3.从数据库中搜索，总结了 41例中国CdLS患者，基因型以NIPBL变异(83.33％)居多，中国人群与不同地区相比，这些特征中的8个临床特征连眉/浓眉、长睫毛、高腭弓、肢体短小、断掌、胃食管反流、眼睑下垂、听力障碍有显著差异。 4.iPS细胞模型的建立和鉴定:重编程后，4株携带NIPBL基因变异和HD4C8基因变异的患儿来源的PBMC呈现出显著的胚胎干细胞形态。重编程后,验证了多能性干性标志物的表达，还可自分化形成典型的拟胚体结构，进而检测不同胚层特异性标志物的差异性表达。本次构建的iPS细胞拥有和患者相同的基因变异，核型无异常，且外源质粒基因未整合。 5.与正常对照组相比，NIPBL变异的iPS细胞增殖显著降低，细胞周期分析发现细胞周期阻滞在G0/G1期，符合生长迟缓的临床特征。 6.与正常对照相比，患者iPSC中NIPBL及CCND1 mRNA表达水平明显降低，但NIPBL变异并不影响其胞内分布。Western blot分析表明NIPBL变异导致NIPBL及CCND1蛋白水平显著降低。 7.应用Wnt信号激活剂LiCl可改善周期抑制情况。采用5mMLiCl干预，发现细胞的增殖能力显著提高，细胞周期G0/G1期抑制被改善，CCND1表达水平显著升高。结论： 1.本研究所纳入病例按表型报道和按共识评分均为典型的CdLS,具有颅面部特征、手足短小、生长发育迟缓、智力障碍、隐睾典型特征。 2.3例经生长激素激发实验，证实存在生长激素缺乏，经应用生长激素干预可提高生长速率。 3.本研究报道了 12例中国CdLS病人的临床及遗传学特征，其中有8例新发致病性变异，拓展了基因谱。 4.阐述了NIPBL基因变异的无义变异、移码变异较剪接、错义变异表现出更严重的临床表型。中国CdLS儿童基因型以NIPBL(83.33％)居多，中国人群与其他国家地区表型相似，同时发现8个显著差异的临床特征。 5.首次采用非整合重编程技术成功构建了 PBMC来源的CdLS特异性的iPS细胞，建立了 CdLS的iPS细胞模型。 6.基于iPS细胞模型，研究发现细胞增殖缓慢。证明了由于NIPBL基因变异导致mRNA和蛋白表达水平下降，从而致Wnt通路受阻，细胞周期阻滞，细胞增殖降低，符合生长迟缓的临床特征 7.应用Wnt信号的激动剂LiCl可改善细胞增殖，为研究CdLS的生长迟缓机制研究提供了新的思路，为下一步的药物筛选提供了细胞学的研究模型。收起

关键词 : 儿童患者德朗热综合征 NIPBL基因生长迟缓细胞增殖

4. NIPBL基因在人乳腺癌细胞中的作用及其分子机制研究

[学位论文] 周欢欢温州医科大学 2018年硕士导师: 王晓稼共70页

摘要 : 背景：乳腺癌是一种高度恶性并且发病率很高的恶性肿瘤。虽然乳腺癌的诊断和治疗取得了很大进展，但乳腺癌仍然是全世界妇女癌症相关死亡的主要原因。遗传因素、环境因素、生活方式等是乳腺癌公认的致病因素，但导致乳腺癌发病的分子机制及原因... 展开背景：乳腺癌是一种高度恶性并且发病率很高的恶性肿瘤。虽然乳腺癌的诊断和治疗取得了很大进展，但乳腺癌仍然是全世界妇女癌症相关死亡的主要原因。遗传因素、环境因素、生活方式等是乳腺癌公认的致病因素，但导致乳腺癌发病的分子机制及原因还尚未完全明确。目前有研究报道CHEK2, ATM, BRIP1,TP53, CDH1, PTEN, PALB2 and STK11等基因跟罹患乳腺癌的风险有关。21基因检测技术现在越来越多为临床医生对低复发风险的乳腺癌患者决策后续治疗提供帮助。21基因检测通过检测16个肿瘤基因和5个内参基因以计算复发分数来预测复发风险。目前个体化治疗是乳腺癌治疗的一大热点，越来越多的基因检测公司通过检测患者血液或组织中乳腺癌相关基因的突变情况为患者选择治疗方案提供建议。化疗，内分泌治疗及靶向治疗是乳腺癌全身治疗的主要方式。然而耐药性的发生大大降低了治疗的疗效，影响患者的预后。遗憾的是乳腺癌的耐药机制尚未明确，目前有研究表明某些基因突变能导致耐药的发生。发现预测乳腺恶性肿瘤易感性或作为治疗靶点或提高药物敏感性的新基因是乳腺癌研究的重要领域。 NIPBL基因最早在德朗综合征（Cornelia de Lange syndrome，CdLS）中发现，与果蝇中的Nipped-B基因同源。其编码的NIPBL蛋白是Cohesin复合体的装载蛋白，结合Cohesin复合体并将Cohesin复合体装载在染色体特定位置上，介导姐妹染色单体聚合在一起，参与细胞有丝分裂和减数分裂。NIPBL基因还参与其他基因的表达及DNA双链断裂修复。NIPBL基因突变会影响Cohesin复合物的功能，并可能导致肿瘤的发生。目前越来越多的研究发现NIPBL与癌症的发生发展有关。已有研究报道 NIPBL 基因与结肠癌，胃癌，子宫内膜癌，非小细胞肺癌有关。但是NIPBL基因在乳腺癌中的作用尚未报道。本研究着重研究NIPBL基因在乳腺癌细胞中的作用。目的: NIPBL基因不仅参与Cohesin复合体与染色体的结合，还参与了其他基因表达的调控及DNA双链断裂修复。有研究报导NIPBL基因可能与结肠癌，胃癌，子宫内膜癌，非小细胞肺癌的发生发展有关。但是具体的机制尚未明确。本实验通过下调乳腺癌细胞 NIPBL 基因，观察细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学功能现象并研究其发生的可能机制来研究NIPBL基因在乳腺癌中的作用。方法: 收集4株乳腺癌细胞株的总蛋白，通过蛋白印迹实验筛选出NIPBL高表达的乳腺癌细胞株。用RNA干扰的方法下调乳腺癌细胞中的NIPBL蛋白。在6 孔板中均匀接种乳腺癌细胞，待细胞长到约占 6 孔板的 50%-70%后转染 si-NC,si-NIPBL1,si-NIPBL2。48小时后，收集转染后的细胞。对转染后的细胞进行CCK8 实验，克隆形成实验来观察 NIPBL 基因对乳腺癌细胞增殖能力的影响。对转染48小时后的细胞进行计数，取5-7x105细胞接种到Ibidi插件的每个小孔，待细胞贴壁后轻轻拔出Ibidi插件，换无血清培养基。在拔除插件后的0小时， 24小时，48小时及72小时观察细胞迁移情况。对转染48小时后的细胞计数，取105细胞至盛放在12孔板的transwell小室，小室里面盛放无血清培养基，小室外面放含血清的培养基，待48后染色观察细胞的侵袭情况。收集转染48小时后的细胞至流式管中（约106个细胞），离心清洗离心倒上清液后加入DNA染色液（Staining solution）和渗透液（Permeabilizationsolution），混匀后避光孵育 30 分钟，上流式细胞仪检测细胞周期分布；用相同的方法收集转染48小时后细胞至流式管后，加入FITC Annexin、PI和Binding buffer，混匀后避光孵育 15 分钟，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。用细胞刮刮取转染48小时后的细胞于1.5ml ep管，离心舍弃上清液，加ripa裂解液，于冰上裂解30分钟提取蛋白。用BCA方法测蛋白浓度,加loading-buffer后加热使蛋白变性。通过SDS－PAGE电泳分离不同大小的蛋白，再通过转膜技术将蛋白从分离胶转移到 PVDF 膜上。孵育目的蛋白所对应的一抗和二抗后，在凝胶成像系统使用蛋白显影液使蛋白显影并分析蛋白条带结果。结果: Si-NIPBL能有效下调MCF7及Bcap37乳腺癌细胞中的NIPBL蛋白。si-NIPBL转染后的MCF7及Bcap37乳腺癌细胞的增殖能力较对照组低。MCF7乳腺癌细胞在被敲低NIPBL蛋白后其增殖抑制率可达50%以上。Bcap37乳腺癌细胞在被敲低 NIPBL 蛋白后其增殖抑制率可达 40%以上。Si-NIPBL 转染后的MCF7 及 Bcap37 乳腺癌细胞的细胞克隆形成能力降低。下调 NIPBL 蛋白后的MCF7细胞的克隆形成率降至10%以下，Bcap37细胞的克隆形成率降至20%以下。Si-NIPBL 转染后的 MCF7 及 Bcap37 乳腺癌细胞的迁移能力及侵袭能力下降。Si-NIPBL转染后的MCF7及Bcap37乳腺癌细胞阻滞在G0/G1期，并且引起CDK4蛋白及cyclinD1蛋白的减少。Si-NIPBL转染后的MCF7及Bcap37乳腺癌细胞更容易发生凋亡并且导致cleaved PARP, cleaved caspase 3, cleaved caspase 9 and BAX蛋白的增多。通过Westernblot发现si-NIPBL转染后的MCF7及Bcap37乳腺癌细胞LC3-II, P62蛋白上调，P-4EBP1, P-mTOR蛋白表达上调。结论: NIPBL基因能影响乳腺癌细胞增殖、细胞侵袭、细胞凋亡、细胞周期与细胞自噬。并且其机制可能是涉及了 mTOR 信号通路和凋亡周期相关基因的变化。收起

关键词 : 乳腺癌 NIPBL基因细胞增殖侵袭迁移分子机制

5. Foxa2基因与NIPBL缺陷小鼠房间隔缺损形成的相关性研究

[学位论文] 张猛石河子大学 2019年硕士导师: 李芳君共44页

摘要 : 背景：德朗热综合征（CorneliadeLangeSyndrome，CdLS)是一种以多系统发育障碍为表现的遗传性疾病，通常会表现为生长发育的障碍、上肢及手部畸形、精神发育迟滞、行为的异常以及心脏间隔的缺损。在总人群中发病率为1∶10000，该疾病的发生对患者生活... 展开背景：德朗热综合征（CorneliadeLangeSyndrome，CdLS)是一种以多系统发育障碍为表现的遗传性疾病，通常会表现为生长发育的障碍、上肢及手部畸形、精神发育迟滞、行为的异常以及心脏间隔的缺损。在总人群中发病率为1∶10000，该疾病的发生对患者生活质量以及家庭造成严重的经济负担和影响。CdLS有着较高的死亡率，死亡原因与先天性器官发育异常有关，尤其是先心病，其中室间隔和房间隔缺损是最常见的[1]。目前研究发现CdLS的遗传方式主要有常染色体显性遗传以及X-锁链遗传两种方式。其中可导致常染色体显性遗传德朗热综合症（CdLS）的Nipped-B相似基因，既Nipped-B-like（NIPBL）于2004年在Tonkin等人的研究中被发现[2]。Kawauch等人报道了NIPBL+/-携带单倍体NIPBL基因的转基因小鼠。大约所有75～80%NIPBL+/-小鼠在出生后4周内死亡，到出生前（E17.5–E18.5），所有后代的基因型41%存在突变，提示了接近正常的50%孟德尔分布。在E17.5–E18.5，有接近一半NIPBL+/-胚胎发现有巨大的房间隔缺损，心室和心室肌的异常也被发现。研究表明NIPBL基因水平降低的最直接影响，是减少SOX17或ForkheadboxA2(Foxa2)的表达水平导致肠管发育缺陷。更重要的是，当SOX17和Foxa2表达水平同时减少，近60%的胚胎显示肠管发育严重缺陷及肠管缺陷的胚胎率急剧增加[3]。表明了SOX17和Foxa2这些基因在心脏和内脏器官的发育成熟过程中起到重要的作用，这些基因的主要功能是调节内胚层发育[4]。心脏和肠管的发育均来自于共同的内胚层，心脏的发育变化比肠管的发育更加复杂，在内胚层的分化过程中SOX17和Foxa2均有一定程度的变化。同时Foxa2在内胚层和中胚层轴向（节点和脊索）上表达水平显著高于其他内胚层标记基因[5]，且表达范围涉及到外延、心肌、心内膜，以及前心，流出道和心垫[6]。因此，我们推测：NIPBL+/-小鼠模型中房间隔缺损的形成可能与Foxa2基因表达下调有关。目的：本研究通过测量小鼠体重对小鼠的生长发育情况进行初步评估，同时探讨转录因子Foxa2基因在心脏组织的表达，旨在研究NIPBL+/-小鼠模型中房间隔缺损的形成与Foxa2基因表达关系。为CdLS及先天性心脏病（Congenitalheartdefects，CHD）的诊断和干预提供新的策略和思路。方法：以NIPBL+/-小鼠为实验组，野生型NIPBL+/+小鼠为对照组小鼠分别测量小鼠4周时体重，记录数据。取小鼠心脏组织，部分制作病理切片、HE染色，观察NIPBL基因缺陷对小鼠心脏发育变化的影响，以及房间隔缺损处的结构特征。剩余心脏组织使用反转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)的方法检测Foxa2在实验组及对照组心脏组织的mRNA水平，运用Western印迹方法来检测以上细胞样本中的Foxa2基因的蛋白表达水平。结果：NIPBL缺陷小鼠心脏病理切片房间隔处见异常缺损，实验组小鼠体重低于对照组，P＜0.05。同时实验组房间隔无缺损样本也伴随有Foxa2基因的表达降低及蛋白表达下降，P＜0.05，差异有统计学意义。结论：NIPBL+/-基因缺陷鼠中Foxa2基因表达降低，在一定程度上导致小鼠生长发育迟缓，体重下降。NIPBL缺陷小鼠心脏房间隔处异常缺损可能与小鼠NIPBL基因缺陷致使Foxa2基因在心肌细胞表达量下降有关。收起

关键词 : 德朗热综合征房间隔缺损 CdLS基因 NIPBL缺陷 Foxa2基因动物模型

6. 运用细胞和分子遗传学方法对Cornelia de lange综合征患者进行遗传诊断

[学位论文] 钟秋连中南大学 2011年硕士导师: 邬玲仟;梁德生;潘乾共65页

摘要 : 背景: Cornelia de Lange综合征(Comelia de Lange Syndrome)是一类罕见的累及多器官系统的遗传异质性疾病，主要特征是特殊面容、宫内及出生后生长迟滞、多毛症、上肢复位缺陷(可表现为上肢指骨、掌骨细微异常甚至手指畸形)，颅面部的特征包括连眉、... 展开背景: Cornelia de Lange综合征(Comelia de Lange Syndrome)是一类罕见的累及多器官系统的遗传异质性疾病，主要特征是特殊面容、宫内及出生后生长迟滞、多毛症、上肢复位缺陷(可表现为上肢指骨、掌骨细微异常甚至手指畸形)，颅面部的特征包括连眉、弓形眉、睫毛长且浓密，鼻子短且鼻孔前倾，牙齿小且牙间隙宽，小颌等。常见的器官异常包括上睑下垂、近视、肠旋转不良、隐睾、尿道下裂、幽门狭窄、先天性膈疝、室中隔缺损、癫痫和听力丧失等。患者通常存在严重的智力障碍问题，IQ值介于30～120之间，平均值为53[1]。约65％的患者是由以下三个基因突变导致：NIPBL(占50-60％)、SMC1A及SMC3(占5％)。这三个基因都与黏连蛋白(cohesin)有关，NIPBL基因为黏连蛋白的调控基因，SMC1A和SMC3基因编码黏连蛋白的结构蛋白亚基。目的:运用细胞遗传学和分子遗传学方法对医学遗传学国家重点实验室收集到的4个Comelia de Lange综合征家系进行遗传学分析，进一步明确该病的分子机制，为疾病的诊断和产前诊断提供依据。方法:对本室收集到的4个Cornelia de Lange综合征家系行外周血常规G显带及高分辨染色体分析；进行基因组DNA的提取，利用聚合酶链式反应(PCR)、逆转录PCR、DNA直接测序法检测NIPBL、SMC1A及SMC3基因突变；对检测到的新突变用PCR测序的方法在100个健康人群中进行筛查。对未发现基因位点突变但表型严重的先证者行全基因组拷贝数变异检测。结果:4个先证者行常规G显带及高分辨染色体核型分析显示外周血核型正常；第1例患儿NIPBL、SMC1A及SMC3基因检测均未发现致病突变，全基因组拷贝数分析未发现致病的拷贝数变异；第2例先证者.NIPBL基因20号外显子检测到c.4321G>T杂合突变，文献已有致病性报道；第3例先证者NIPBL基因38号内含子c.6589+5G>C杂合突变，其父母该位点正常，对先证者cDNA进行RT-PCR检测发现该先证者NIPBL基因38号外显子剪接发生改变，产生两种转录本，一种为野生型转录本，一种为缺失38号外显子的转录本。对100个正常个体行该位点突变筛查未发现突变。第4例先证者NIPBL和SMC1A和SMC3基因均未发现突变。结论: NIPBL基因c.4321 G>T杂合突变及c.6589+5G>C杂合突变分别是导致先证者2和先证者3的致病突变，其中c.4321G>T杂合突变为已报道的致病突变，c.6589+5G>C杂合突变目前国内外未见报道，为新突变。通过突变分析，从基因水平上确诊先证者2及先证者3为Cornelia de Lange综合征患者。收起

关键词 : Comelia de Lange综合征遗传异质性疾病 NIPBL基因 SMC1A基因基因突变手指畸形分子遗传学

7. NIPBL基因对小鼠骨髓间充质干细胞增殖分化能力的影响

[学位论文] 姜德坤石河子大学 2021年硕士导师: 张惠荣共53页

摘要 : 目的： CorneliadeLange综合征（CdLS）是一种遗传性疾病，目前研究表明NIPBL基因是其主要的致病基因。NIPBL基因突变可能导致其骨骼发育异常。因此，本研究通过体外细胞学实验，探究NIPBL基因对小鼠骨髓间充质干细胞的增殖分化能力的影响。为进... 展开目的： CorneliadeLange综合征（CdLS）是一种遗传性疾病，目前研究表明NIPBL基因是其主要的致病基因。NIPBL基因突变可能导致其骨骼发育异常。因此，本研究通过体外细胞学实验，探究NIPBL基因对小鼠骨髓间充质干细胞的增殖分化能力的影响。为进一步探索CdLS的发病机制以及新治疗方案的确定提供理论依据和实验依据。方法：采用第三代c57小鼠骨髓间充质干细胞进行实验。构建3种携带NIPBL-siRNA的慢病毒载体后转染细胞，通过倒置相差荧光显微镜观察慢病毒转染结果，使用real-timePCR来检测NIPBL基因的mRNA表达量，根据PCR的结果选择效果最好的一种慢病毒载体作为实验组。后续实验分组为：抑制NIPBL基因表达的实验组、阴性对照组和空白对照组。慢病毒转染后，CCK-8法检测转染后各组细胞增殖能力。分别将转染后各组细胞进行成骨诱导、成软骨诱导、成脂诱导分化培养。分别在诱导的第7天、14天、21天提取3组细胞的RNA和蛋白，用RT-PCR、westernblot检测OCN、BMP-2、RUNX-2、SOX-9、COL2A1、PPAR-γ基因的mRNA及蛋白表达水平。检测碱性磷酸酶活性，观察茜素红染色钙结节、阿利辛蓝染色软骨细胞、油红O染色脂质细胞的结果。结果：（1）三种慢病毒载体转染小鼠骨髓间充质干细胞的结果：慢病毒介导NIPBL基因转染骨髓间充质干细胞后，real-timePCR检测结果显示NIPBL基因mRNA表达量明显降低（Plt;0.05）,其中以NIPBL-siRNA-3沉默效果最佳，用其进行后续实验研究。（2）转染后各组细胞增殖能力比较：NIPBL基因沉默后，CCK8检测结果显示实验组细胞增殖能力较对照组明显降低（Plt;0.05），证明沉默NIPBL基因后降低骨髓间充质干细胞的增殖能力。（3）成骨诱导培养及相关基因表达情况的比较：成骨诱导培养后，在第7天、14天、21天提取各组细胞的mRNA和蛋白，real-timePCR和westernblot实验结果显示：OCN、BMP-2、RUNX-2的mRNA和蛋白表达量在实验组中要比对照组低（Plt;0.05），实验组ALP活性明显降低，茜素红染色钙结节在实验组中要比对照组低(Plt;0.05)。（4）成软骨诱导培养及相关基因表达情况的比较：成软骨诱导培养后，在第7天、14天、21天提取各组细胞的mRNA和蛋白，real-timePCR和westernblot实验结果显示：SOX-9、COL2A1的mRNA和蛋白表达量在实验组中要比对照组低（Plt;0.05），阿利辛蓝染色结果显示软骨细胞在实验组中要比对照组少（Plt;0.05）。（5）成脂诱导培养及相关基因表达情况的比较：成脂诱导培养后，在第7天、14天、21天提取各组细胞的mRNA和蛋白，real-timePCR和westernblot实验结果显示：PPAR-γ的mRNA和蛋白在实验组中的表达量要比对照组低（Plt;0.05）。油红O染色结果显示脂质积累在实验组中要比对照组少（Plt;0.05）。结论：慢病毒介导沉默NIPBL基因后小鼠骨髓间充质干细胞增殖能力降低，抑制其向成骨、成软骨和成脂分化，降低了骨髓间充质干细胞增殖分化能力。收起

关键词 : CorneliadeLange综合征 NIPBL基因骨髓间充质干细胞细胞分化细胞增殖

8. NIPBL基因对小鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响与TGF-β1/Smad信号通路相关性研究

[学位论文] 马雯晴石河子大学 2022年硕士导师: 张惠荣共60页

摘要 : 目的本研究通过体外细胞学实验，将探究NIPBL基因在小鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响，探索TGF-β1/Smad信号通路在CorneliadeLange综合征模型小鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用和可能机制，探讨NIPBL基因与TGF-β1/Smad信号通路... 展开目的本研究通过体外细胞学实验，将探究NIPBL基因在小鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响，探索TGF-β1/Smad信号通路在CorneliadeLange综合征模型小鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用和可能机制，探讨NIPBL基因与TGF-β1/Smad信号通路在CdLS骨骼发育中的相关性，将从分子层面剖析NIPBL基因在CorneliadeLange综合征发病中的作用机制，为该疾病的临床有效干预提供新的思路。方法利用培养至第三代C57小鼠骨髓间充质干细胞开展本研究。构建3种携带NIPBL-shRNA的慢病毒载体转染小鼠骨髓间充质干细胞，通过倒置荧光显微镜观察慢病毒转染效率，使用实时荧光定量聚合酶链反应法（RT-qPCR）检测NIPBL基因的mRNA表达量，根据RT-qPCR的结果选择效果最佳的一种慢病毒载体作为实验组。后续实验组分别包括：抑制NIPBL基因表达的实验组（sh-NIPBL组）、未携带目的基因的慢病毒空载体干预的阴性对照组（sh-NC组）和未进行慢病毒干预的空白对照组(Control组)。慢病毒干预得到转染稳定株后，分别将3组细胞成软骨诱导分化培养，于诱导的第21天：测量比较3组软骨微球的最大横截面周长，观察3组阿利辛蓝染色软骨细胞的结果，行免疫荧光染色，观察CollagenⅡ的分布与含量，Westernblot检测Sox9、CollagenⅡ、TGF-β1、Smad2、Smad4基因的蛋白表达水平；分别在诱导的第3天、7天、14天、21天提取3组细胞的总RNA，用RT-qPCR法检测Sox9、CollagenⅡ、TGF-β1、Smad2、Smad4基因的mRNA表达水平。结果（1）慢病毒干预小鼠骨髓间充质干细胞后，RT-qPCR检测结果显示NIPBL基因mRNA表达量明显降低（Plt;0.05），其中以MOI=60sh-NIPBL-3敲低效果最佳，用其进行后续实验研究。（2）成骨诱导第21天，Alcianblue染色后在倒置显微镜下观察sh-NC组和Control组较实验组可见更多的蓝色软骨内酸性黏多糖，且软骨微球的最大横截面周长更长。（3）sh-NIPBL组骨髓间充质干细胞中CollagenⅡ、Sox9的蛋白表达量均低于对照组(Plt;0.05)；（4）sh-NIPBL组在成软骨诱导后，TGF-β1、Smad2、Smad4基因和蛋白的表达水平均低于对照组(Plt;0.05)；结论慢病毒敲低NIPBL基因的表达降低了骨髓间充质干细胞的成软骨分化能力，TGF-β1/Smad信号通路中的TGF-β1、Smad2、Smad4基因和蛋白表达水平也随之下降，说明TGF-β1/Smad信号通路可能参与介导了由NIPBL基因突变所致的CdLS骨骼发育异常的过程。收起

关键词 : CorneliadeLange综合征骨髓间充质干细胞 NIPBL基因 TGF-&beta 1/Smad信号通路成软骨分化

9. 敲低NIPBL基因对小鼠骨髓间充质干细胞成骨及β连环蛋白磷酸化的影响

[学位论文] 刘辉石河子大学 2022年硕士导师: 张惠荣共53页

摘要 : 目的：德朗热综合征（CorneliadeLangeSyndrom,CDLS）是由于发育早期多种基因表达异常引起的临床罕见疾病，主要的临床特征是骨骼发育畸形。目前研究表明，NIPBL基因低表达与CDLS患者骨骼发育异常密切相关[1]。本实验通过敲低骨髓间充质干细胞（Bonem... 展开目的：德朗热综合征（CorneliadeLangeSyndrom,CDLS）是由于发育早期多种基因表达异常引起的临床罕见疾病，主要的临床特征是骨骼发育畸形。目前研究表明，NIPBL基因低表达与CDLS患者骨骼发育异常密切相关[1]。本实验通过敲低骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）中的NIPBL基因，使其低表达，探讨NIPBL基因对BMSCs在成骨分化方面的影响及可能的机制，为CDLS患儿骨骼畸形的可逆性治疗提供新的理论依据。方法：C57BL/6的专用细胞培养基培养BMSCs至第3代，用细胞免疫荧光检测BMSCs表面抗原CD44的表达验证细胞种类。培养BMSCs至对数期后，按照慢病毒感染复数（multiplicityofinfection,MOI）为20、40、60、80分别预转染BMSCs，找到其最适MOI。按照最适MOI转染NIPBL-shRNA（5，-GCATCCGAGTCTAATGTTTGA-3，）和空载体慢病毒（shRNA-NC），观察细胞荧光量达80%-90%时筛选稳转细胞系，实时荧光定量PCR（QRT-PCR）检测细胞稳转后NIPBLmRNA的相对表达量，验证NIPBL低表达组的BMSCs细胞系是否构建成功。BMSCs分为空白组、空载体组及NIPBL敲低组，相同条件下用成骨诱导培养基培养，定期观察各组细胞形状、钙盐结节等变化情况。在成骨诱导第21天用茜素红染色（Alizarinstaining）检测细胞的钙盐成分，并用免疫印迹实验（Western-blot）检测β连环蛋白（β-catenin）及磷酸化β连环蛋白（P-β-catenin）的表达量，QRT-PCR检测Lrp5mRNA的表达情况。结果：（1）与空载体组及空白组比较，经慢病毒转染后的敲低组中NIPBLmRNA的相对表达量明显降低，存在统计学差异（Plt;0.05）。空载体组与空白组NIPBLmRNA的相对表达量相当，无统计学差异（Pgt;0.05）。这表示已成功建立了NIPBL基因低表达的细胞系，并且病毒衣壳对NIPBL基因的正常表达没有明显影响。（2）三组细胞在成骨分化过程中形态发生了明显变化，诱导第21天Alizarin染色发现NIPBL敲低组形成的红色钙盐颗粒比空白组和空载体组少，结果提示敲低NIPBL可以抑制BMSCs的成骨分化。（3）在成骨定向诱导21天后，NIPBL敲低组的β-catenin蛋白、P-β-catenin蛋白以及Lrp5mRNA表达水平均低于空白组和空载体组，存在统计学差异（Plt;0.001）；空白组和空载体组的β-catenin蛋白、P-β-catenin蛋白以及Lrp5mRNA表达水平无统计学差异（Pgt;0.05）。结论：慢病毒敲低BMSCs中NIPBL基因的表达抑制了其成骨定向分化，Wnt/β-catenin通路中表面受体Lrp5、转录共调节分子β-catenin表达也随之下降，但P-β-catenin（失活状态）表达上升。这表明Wnt/β-catenin通路可能参与了NIPBL基因突变所致的CdLS骨骼发育异常的过程。收起

关键词 : 德朗热综合征 NIPBL基因成骨细胞 &beta 连环蛋白低密度脂蛋白相关受体5

10. 敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力

[学位论文] 林明石河子大学 2020年硕士导师: 张惠荣共54页

摘要 : 德朗热综合征(Cornelia de Lange Syndrome，CdLS)是全身多种器官不同程度受累及的罕见遗传性疾病，其主要临床特征包括：智力障碍、特征性面容、上肢及脊柱畸形、多毛症等多种症状。目前已发现有7个基因（NIPBL、SMC1A、RAD21、BRD4、HDAC8、SMC3、A... 展开德朗热综合征(Cornelia de Lange Syndrome，CdLS)是全身多种器官不同程度受累及的罕见遗传性疾病，其主要临床特征包括：智力障碍、特征性面容、上肢及脊柱畸形、多毛症等多种症状。目前已发现有7个基因（NIPBL、SMC1A、RAD21、BRD4、HDAC8、SMC3、ANKRD11）的突变参与CdLS的发生，约占70%CdLS患者检测出NIPBL基因发生突变。目的：观察NIPBL基因在细胞水平对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力产生的影响。方法：采用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠构建NIPBL基因缺陷杂合子小鼠模型(NIPBL+/-)并将其作为实验组，野生型(NIPBL+/+)小鼠作为对照组。全骨髓贴壁法分离两组小鼠的骨髓间充质干细胞，培养到第3天倒置显微镜下对其细胞形态进行观察。为了鉴定细胞类型，细胞传至第3代时采用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。用CCK-8法对两组细胞增殖能力进行测定并比较，然后将细胞培养基更换为成骨诱导培养基后继续培养，用RT-PCR和Western Blot技术检测Runx2、OCN基因及其蛋白量的表达。在诱导第3，7，10天检测碱性磷酸酶活性，在诱导14天观察两组细胞诱导后形态学变化，成骨诱导第21天用茜素红染色比较两组细胞钙结节产量。结果：（1）NIPBL基因剔除小鼠鉴定：NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠杂交后代NIPBL基因剔除(NIPBL+/-)小鼠生时形态小、生长缓慢，RT-PCR技术鉴定出NIPBL基因缺失。（2）两组小鼠骨髓间充质干细胞鉴定：实验组NIPBL+/-小鼠骨髓间充质干细胞:造血系特异性标记分子CD34(0.25%)、CD11b(0.64%)、CD45(0.78%)呈阴性表达，间充质干细胞特异性标记分子Sca-1(95.19%)、CD44(78.23%)、CD106(39.26%)呈阳性表达。对照组NIPBL+/+小鼠骨髓间充质干细胞:造血系特异性标记分子CD34(0.30%)、CD11b(0.23%)、CD45(0.47%)呈阴性表达，间充质干细胞特异性标记分子Sca-1(94.46%)、CD44(77.49%)、CD106(36.35%)呈阳性表达。结果提示从原代培养的细胞来源于小鼠骨髓间充质。（3）比较两组小鼠骨髓间充质干细胞生长增殖情况：相较于对照组，实验组细胞的增殖能力在前5d差异不大，在第6d以后对照组细胞增殖能力提高显著，而实验组提高则相对缓慢。（4）两组小鼠骨髓间充质干细胞向成骨方向分化能力比较：从形态学观察发现对照组骨髓间充质干细胞成骨诱导7d后细胞排列更加紧密，细胞形态逐渐出现变化，由长梭形向不规则形转变，出现散在的细胞结节，结构层数增加，实验组骨髓间充质干细胞形态改变与对照组类似，但结节明显更少；成骨诱导14d对照组细胞呈“铺路石”样改变，且细胞形态依然饱满，实验组细胞颗粒量较低。两组细胞碱性磷酸酶活性均在第7d达到峰值，实验组碱性磷酸酶活性均显著低于对照组(P＜0.05)。实验组OCN、Runx2基因表达量均显著低于对照组(P＜0.05)，Runx2、OCN基因水平随成骨诱导时间增加呈上升趋势。在成骨诱导后的第7，14，21，28天，实验组的Runx2蛋白表达量均显著低于对照组(P7、21d＜0.05，P14、28d＜0.01)；在成骨诱导的第21，28天，实验组的OCN蛋白表达量显著低于对照组(P21d＜0.05，P28d＜0.001)，Runx2、OCN蛋白水平在21d前随成骨诱导时间增加呈上升趋势，随后下降。成骨诱导第21d，茜素红染色后显微镜下观察发现，对照组钙结节数量明显高于实验组。说明NIPBL基因敲除下调了小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力。结论：敲除NIPBL基因降低了小鼠骨髓间充质干细胞的增殖、成骨分化能力。收起

关键词 : 德朗热综合征发病机制 NIPBL基因骨髓间充质干细胞细胞增殖成骨分化能力