中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 万乐人北京大学 2003年硕士导师: 周春燕共53页

摘要 : CD34是一种高度糖基化的膜蛋白,在早期造血干细胞和内皮细胞以及胚胎成纤维细胞表达.文献报道在CD34阳性的造血干细胞系中,在PKC的作用下,CD34分子被高度磷酸化,并迅速实现了膜上调,这种上调是不依赖于新生的CD34分子的mRNA或蛋白质的.但在CD34阳性的... 展开

关键词 : CD34 膜表达蛋白激酶C

2. NR2B亚单位C末端调控NMDA受体运输和膜表达的分子机制

[学位论文] 杨巍浙江大学 2008年博士导师: 罗建红共100页

摘要 : NMDA受体是一种谷氨酸门控的离子通道，与许多复杂的生理和病理机制有关，如突触的可塑性、长时程增强作用(LTP)、学习和记忆、兴奋性神经毒性、神经退行性变性疾病等。NMDA受体由NR1、NR2和NR3亚单位装配组成异聚体离子通道，在内质网组成具有不同生... 展开 NMDA受体是一种谷氨酸门控的离子通道，与许多复杂的生理和病理机制有关，如突触的可塑性、长时程增强作用(LTP)、学习和记忆、兴奋性神经毒性、神经退行性变性疾病等。NMDA受体由NR1、NR2和NR3亚单位装配组成异聚体离子通道，在内质网组成具有不同生理学和药理学功能以及不同突触靶向的功能性NMDA受体通道。已知NR1亚单位是一个独立的基因家族，通过选择性剪接可产生8个剪接变体；NR2共有4个相关的基因，NR2A、NR2B、NR2C和NR2D；NR3则有2个基因，分别为NR3A和NR3B。目前认为，NMDA受体是分别由两个结合甘氨酸的NR1和两个结合谷氨酸的NR2亚单位组成的异四聚体。因此，NR1/NR2异源二聚体就组成了NMDA受体的基本功能单位。先前的大量研究表明，NMDA受体的不同亚单位单独表达都被滞留在内质网内，只有当NR1与NR2亚单位共同装配才能从内质网输出并表达到细胞膜表面，但其作用机制仍不清楚。近几年来，研究发现NR1亚单位存在一些重要的功能区和调节位点：例如，NR1-1亚单位的C1区存在一个RRR内质网滞留基序(ER retention motif)，使NR1亚单位被滞留在内质网；NR1-4a存在一个共感的PDZ结合区，可以掩盖内质网滞留基序；PKC活化可以帮助NR1-1a表达于细胞膜表面等等。然而，对于NR2B亚单位的内质网滞留机制却仍然知之甚少。与NR1不同的是NR2B亚单位的C末端很长，我们先前的研究已经发现，缺失NR2B亚单位C末端不同区域均未能使得NR2亚单位从内质网输出并获得表面表达，这表明NR2亚单位的内质网滞留机制要比NR1复杂得多。已知NR1-4a单独表达能到达细胞膜表面，为了明确是否是NR2B亚单位C末端决定了它的自身滞留，我们将NR1-4a的C末端替换到NR2B的亚单位C末端。有趣的是，我们发现这样的一个NR2BNR4aC的嵌合体获得了细胞膜表面表达，这个结果表明NR2B亚单位C末端决定了NR2B亚单位的细胞膜表达。但是关于NR2B亚单位C末端如何调控NR2B亚单位的内质网滞留作用仍然不清楚，我们推测并不是由单一位点决定，很可能是通过多个位点协同作用的结果，这还需要进一步的研究证明。另外，关于NR2亚单位单独表达是否能形成功能性受体的研究一直是这个领域的一个热点，目前的主流观点推测NR1是NMDA受体得必需组分，NR2亚单位单独并不能形成有功能得离子通道。基于NR2BNR4aC能单独到达细胞膜表面，我们运用全细胞电生理的方法检测了NR2BNR4aC嵌合体是否能形成有功能的受体通道。电生理结果没有记录到明确的NMDA受体样电流。这个结果提示单独表达NR2亚单位并不能形成有功能的受体通道，只有与NR1共装配才能形成有功能的通道。其次，已知NR1-1a可以通过与NR2装配克服其内质网滞留作用并被输送到细胞膜表面，但其作用机制并不清楚。我们先前的研究试图在NR2上找到克服NR1a内质网滞留基序的功能区，做了各种缺失突变体，但均未能找到特殊的功能区。在本研究中，我们构建了NR2B各种C末端截短质粒，结果发现除了2BA2不能与NR1-1a获得细胞膜表面表达之外，其它的缺失体都能与NR1-1a共表达于细胞膜表面。进一步用全细胞膜片钳技术来记录转染细胞的NMDA受体电流，结果与表面染色结果一致。这些结果表明，NR2B的C末端氨基酸长度对克服NR1-1a的内质网滞留有重要作用，换句话说，NR2亚单位C末端保留三个氨基酸长度对于克服NR1-1a的内质网滞留基序作用是必需的。为了验证这个结果，我们获得了一个NR1-1a-AAA突变体，只把NR1-1a的RRR滞留基序突变成了AAA。然后分别把2BA2与NR1-1a-AAA突变体共转染到HEK293细胞，表面染色结果显示它们能获得细胞膜表达。接下来我们想知道的一个问题是这个氨基酸序列是否具有特异性呢?为了回答这个问题，我们构建了NR2B△5AAAAA突变体，将它与NR1-1a共转染到HEK293细胞后，表面染色和电生理结果都表明它们形成的复合物仍然能够到达细胞膜表面并形成有功能的受体。这个结果表明NR2B第四跨膜区后三个氨基酸长度并没有序列特异性。基于上述结果，本研究第一次发现NR2亚单位C末端保留三个氨基酸长度对于克服NR1-1a的内质网滞留基序是必需的。这种调控机制很可能是通过引发NR1亚单位C末端自身变构的改变，从而掩盖了NR1-1a C末端的内质网滞留基序，使得NR2△3/NR1-1a获得细胞膜表面表达。本研究揭示了一种新的NMDA受体亚单位装配和运输调控机制。另外，本研究运用FRET技术来观察NR2B亚单位的C末端是否影响NMDA受体的装配。将构建好的YFP-2B△2，CFP-2B△2质粒共转染到HEK293细胞，发现它们仍然能够发生FRET，这表明YFP-2B△2与CFP-2B△2能形成复合物。同时，分别将YFP-2B△2与CFP-NR2B或者CFP-NR1-1a共转染到HEK 293细胞，结果发现它们也能发生FRET。这些结果说明缺失了C末端的NR2B亚单位仍然能够与NR1装配形成NMDA受体复合物，提示NR2B的C末端并不是NMDA受体装配的决定位点。最后，在培养的海马神经元中分别单独转染GFP-NR2A，GFP-NR2B，2A△5，2A△3，2A△2，2B△3和2B△2，活细胞表面染色观察它们在神经元的细胞膜表达情况。结果显示2A△5，2A△3，2A△2单独表达到神经元均能到达细胞膜表面，尽管与野生型相比有显著降低。有趣的是，2B△2单独表达在神经元中并不能获得表面表达，但是将NR1-4a与2B△2共转染到神经元中则能够观察到2B△2到达了细胞膜表面，虽然跟野生型相比膜表面表达数目仍然有明显下降。众所周知，在神经元中存在各种内源性的NR1剪接变体，如果NR2能与这些不同的NR1变体装配的话，那么2B△2应该能与NR1-4亚单位装配并到达细胞膜表面，但结果发现2B△2不能到达细胞膜表面。这个结果暗示了一种新的现象，即不同的NR2亚单位并不是随机的与各种NR1变体装配形成NMDA受体，很可能与NR2A和NR2B装配的NR1是不同的变体。综上，本研究主要结论如下： 1)发现NR2BNR4aC的嵌合体能获得细胞膜表面表达，电生理结果提示单独表达NR2亚单位不能形成功能性离子通道； 2)本研究首次发现NR2亚单位C末端保留三个氨基酸长度对于克服NR1-1a的内质网滞留基序是必需的，揭示了一种新的NMDA受体亚单位装配和运输调控机制。收起

关键词 : 亚单位末端调控 NMDA受体运输膜表达

3. Functional Analysis of a CC Chemokine Receptor 5 Mutant

[学位论文] 王菲复旦大学 2003年硕士导师: 罗泽伟共46页

摘要 : CC类趋化因子受体5(CCR5)属于G蛋白偶联的受体家族,也是巨噬细胞趋向性的HIV-1病毒的辅助受体之一.作者在研究CCR5和免疫缺陷的相关性的过程中,在中国人群里发现了一个单核苷酸缺失的突变,CCR5-893(-).该突变在第893号密码处缺失一个核苷酸(T),导致基... 展开

关键词 : CCR5 CCR5-893(-) 膜表达 PHA诱导

4. 三种类型细胞穿膜肽的设计与原核表达及其在对虾细胞中的穿膜效果分析

[学位论文] 李炎中国海洋大学 2019年硕士导师: 郭华荣共130页

摘要 : 对虾是中国一种重要水产养殖经济品种，但各种对虾病毒病的频繁爆发严重制约了对虾养殖业的健康发展，造成了巨大的经济损失。而对虾永生性细胞系的建立将会为对虾病毒的致病机理研究以及抗病毒疫苗的研发提供一种不可或缺的有力研究工具。近30年来，... 展开对虾是中国一种重要水产养殖经济品种，但各种对虾病毒病的频繁爆发严重制约了对虾养殖业的健康发展，造成了巨大的经济损失。而对虾永生性细胞系的建立将会为对虾病毒的致病机理研究以及抗病毒疫苗的研发提供一种不可或缺的有力研究工具。近30年来，各国学者虽然在建立对虾细胞系方面进行了许多尝试和探索，但对虾永生性细胞系一直未能成功建立。通过永生性转化相关基因的过表达已经成功建立了许多哺乳动物细胞系。但由于体外培养对虾细胞存在分裂停滞的问题，导致核酸水平上的各种基因转染方法，在不分裂的对虾细胞中得到的基因表达效率都极低，因而难以实现对虾细胞的诱导转化。细胞穿膜肽具有携带大分子物质穿透细胞膜这一特性，因此，设计并筛选出有效的对虾细胞穿膜肽，并将其用于携带永生性转化相关的功能蛋白进入对虾细胞，则可以解决上述问题，为对虾细胞的永生性转化奠定技术基础。本文首先设计了以下三种类型细胞穿膜肽：①阳离子细胞穿膜肽11R，由11个精氨酸组成；②对虾细胞特异性的疏水性穿膜肽HP（Hydrophobicpenetratingpeptide），由16个疏水性氨基酸组成，序列组成为AILAITAVIAVFIVIF，选自对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28的疏水区域第12-27个氨基酸；③对虾细胞特异性的两亲性穿膜肽AP（Amphotericcellpenetratingpeptide），由疏水性细胞穿透肽HP与核定位信号RTRKRKNSE相连而成，核定位信号取自对虾细胞周期蛋白E(CyclinE)的第23-31个氨基酸，其序列组成为AILAITAVIAVFIVIF-RTRKRKNSE。其次，以eGFP为报告基因，先后成功构建了上述三种类型细胞穿膜肽的原核表达载体：pET30a-11R-eGFP、pET30a-AP-eGFP和pET30a-HP-eGFP，以不含有穿膜肽的pET30a-eGFP作为对照。然后，将以上四种原核表达质粒在大肠杆菌细胞Transetta（DE3）中进行原核表达，并利用pET30a表达载体中融合表达的6×His标签，将表达产物过镍柱，分别纯化上述4种目的蛋白。结果表明，成功原核表达了上述4种eGFP报告基因融合蛋白，纯化后蛋白的终浓度分别为：eGFP蛋白3mg/mL，11R-eGFP蛋白0.7mg/mL，HP-eGFP蛋白0.415mg/mL和AP-eGFP蛋白0.320mg/mL。由于对虾细胞目前没有建立起永生性细胞系，只能进行原代培养，获得大量单层细胞困难，所以利用与对虾细胞亲缘关系较近的昆虫sf9细胞，以eGFP蛋白为阴性对照，筛选穿膜肽11R-eGFP在昆虫sf9细胞中的最佳蛋白添加浓度和最佳孵育时间。结果表明，11R-eGFP蛋白可成功穿膜进入sf9细胞，而eGFP蛋白则不能穿膜进入sf9细胞；在所测试的三个浓度2.5、5和10μM中，以5μM为最佳孵育浓度；在0.25-6h的孵育时间内，4h为最佳孵育时间。因此，11R-eGFP在昆虫sf9细胞中的最佳孵育条件为：孵育浓度为5μM，孵育时间为4h时，细胞穿膜肽11R的穿膜效率最高。经ImageJ软件统计分析可知，11R-eGFP的穿膜效率可达72％。激光共聚焦荧光显微镜观察结果进一步验证了细胞穿膜肽11R可以携带eGFP穿膜进入昆虫sf9细胞内部。穿膜肽11R-eGFP在对虾体外培养细胞中的穿膜效果分析表明，11R-eGFP蛋白也可以成功穿膜进入对虾细胞；5μM的11R-eGFP蛋白孵育体外培养的对虾血淋巴细胞和胚胎细胞4h后的穿膜效率，分别可达70％和10％左右。激光共聚焦显微镜观察也验证了穿膜肽11R可以携带eGFP穿膜进入对虾血淋巴细胞和对虾胚胎细胞内部。疏水性穿膜肽HP-eGFP和两亲性穿膜肽AP-eGFP在昆虫sf9细胞中的穿膜效果分析表明，将5μM的HP-eGFP和AP-eGFP两种蛋白分别孵育昆虫sf9细胞4h后，在荧光显微镜下可观察到弱的绿色荧光。DAPI染色和激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明，细胞穿膜肽HP和AP可以携带eGFP蛋白进入昆虫sf9细胞，但是穿膜效率较低。将5μM的HP-eGFP和AP-eGFP两种蛋白分别孵育原代培养的对虾血淋巴细胞4h后，也仅观察到弱的绿色荧光。DAPI染色后于激光共聚焦显微镜扫描可知，细胞穿膜肽HP和AP可以携带eGFP蛋白进入对虾血淋巴细胞。细胞穿膜肽HP和AP在sf9细胞和对虾血淋巴细胞中的穿膜效果明显低于11R穿膜肽，这可能与HP-eGFP和AP-eGFP两种蛋白的浓度远低于11R-eGFP有关。 Survivin基因的编码区大小为420bp，含有一个BIR结构域，它是少数既能控制细胞周期，又能抑制细胞凋亡的因子。又由于真核表达系统所表达出的蛋白更接近于天然蛋白。基于此，本文又构建了穿膜肽11R的真核融合表达载体pCDNA-11R-survivin-EK。其N端含有11R的细胞穿膜肽，下游引物去掉了终止密码子，并在其羧基端添加肠肽酶（Enterokinase，EK）识别位点（-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-)，以便于后续对组氨酸标签的切除。将pCDNA-11R-survivin-EK转染到哺乳动细胞293T细胞中进行过表达，镍柱纯化表达产物，并未成功得到目的蛋白。而后又构建了穿膜肽11R的原核融合表达载体pET30a-11R-survivin-EK，并成功诱导表达和纯化得到0.174mg/mL的目的蛋白。将重组蛋白11R-survivin-EK按照5μM的最优浓度添加于对虾血淋巴原代培养基中，孵育3h后观察到初步的转化特征，即细胞开始回缩，6h后血淋巴细胞由伸展的长梭形变成圆形，贴壁不紧，易脱落，并悬浮生长。为提高11R-survivin蛋白的永生性转化效果，今后还需要进一步优化原核表达条件，提高该蛋白的表达丰度。以上研究结果为今后利用永生性转化蛋白诱导对虾细胞永生化转化奠定技术基础。收起

关键词 : 对虾病毒病细胞穿膜肽分子设计原核表达对虾细胞穿膜效果

5. 胃癌区域淋巴结转移与肝总动脉鞘膜侵犯的关系研究

[学位论文] 周毅中南大学 2013年硕士导师: 廖国庆共45页

摘要 : 目的：探讨胃癌发展过程中癌细胞对肝总动脉血管鞘膜是否存在侵犯以及可能与鞘膜侵犯有关的临床特征，为胃癌的手术治疗方法提供参考。方法：收集2011年10月至2012年11月由湘雅医院胃肠外科收治的50例胃癌患者术中切除的肝总动脉血管鞘膜标本共... 展开

关键词 : 胃腺肿瘤血管鞘膜蛋白表达病理细胞学

6. 冷激处理减轻茄子冷害及其机理研究

[学位论文] 张婷婷南京农业大学 2018年硕士导师: 郑永华共72页

摘要 : 茄子鲜嫩可口，营养价值高，具有降血脂、预防Ⅱ型糖尿病、保肝等多种保健功效，深受消费者的喜爱。茄子常温贮藏过程中极易腐烂变质。冷链流通和冷藏保鲜是目前商业上应用最为广泛的的贮运保鲜技术。但茄子作为冷敏性果实，不适当的低温环境，极易出... 展开茄子鲜嫩可口，营养价值高，具有降血脂、预防Ⅱ型糖尿病、保肝等多种保健功效，深受消费者的喜爱。茄子常温贮藏过程中极易腐烂变质。冷链流通和冷藏保鲜是目前商业上应用最为广泛的的贮运保鲜技术。但茄子作为冷敏性果实，不适当的低温环境，极易出现冷害症状，从而失去食用品质及商品价值。冷激处理是物理方法，具有无化学残留、操作简易且与采后预冷结合使用等优点。目前，有关冷激处理减轻采后茄子冷害及相关生理机制的研究仍鲜有报道。为此，本文以“大龙”茄子为试材，研究冷激处理抑制茄子果实冷害的效果，对活性氧代谢和膜脂代谢相关酶及膜脂代谢和CBF冷应答途径相关基因表达的影响，以阐明冷激处理减轻茄子采后冷害的可能机理，旨在为改善茄子采后贮藏品质和冷激处理在果蔬贮藏上的应用提供科学依据。主要结果如下: 1.研究4℃贮藏条件下，不同冷激处理时间(0、10、20、30和40min)控制茄子冷害发生的效果。发现冷激处理20min降低茄子果实的冷害指数，延缓果肉的褐变，减轻冷害症状的效果最好，而冷激处理40min无明显减轻冷害效果。因此，再此基础上选用0℃冰水混合物冷激浸泡20min的果实，通过研究膜脂代谢相关指标，揭示冷激处理减轻茄子果实冷害的机理。研究表明20min的冷激处理可以抑制PLD和LOX活性上升，减轻不饱和脂肪酸中亚油酸和亚麻酸的氧化，抑制饱和脂肪酸中棕榈酸和硬脂酸相对含量的增加，维持较高膜脂脂肪酸不饱和度，降低相对电导率和MDA含量。这些结果表明20min的冷激处理主要通过抑制膜脂代谢，降低了细胞膜通透性，保持膜结构的完整性，从而延缓冷害的发生。 2.低温胁迫使PPO和POD活性上升，SOD、CAT、APX抗氧化酶活性下降，导致活性氧代谢失调。而冷激处理一方面显著提高SOD、APX和CAT活性氧相关酶活性，另一方面诱导非酶促内源抗氧化物质总酚、AsA和GSH含量的积累，提高DPPH自由基清除能力，从而降低冷藏中后期O2·-生成速率及H2O2含量。此外冷激处理还抑制PPO和POD活性，提高了渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸含量，这些结果表明，冷激处理主要通过平衡了细胞的活性氧代谢，提高渗透调节物质含量，增强茄子的低温耐受性，减轻茄子冷害症状。 3.低温条件可诱导SmCBF1、SmCBF2和SmCBF3的表达，而冷激处理SmCBF1、SmCBF2和SmCBF3在低温贮藏2h时急剧增加且达到峰值，随后下降，但仍显著高于对照组。此外，低温胁迫导致了SmLOX和贮藏前期SmPLDa3表达量的增加及ω-3类型的FAD3基因表达量下降，但冷激处理显著的抑制了SmLOX和SmPLDα3表达量的上调，保持SmFAD3基因的高水平表达，这些结果表明，冷激处理主要通过激活CBF低温应答途径，调节膜脂代谢相关酶基因表达，从而减轻茄子冷害。收起

关键词 : 茄子冷害冷激处理活性氧代谢膜脂代谢基因表达

7. 不同形态铁在肉仔鸡小肠中的吸收特点及其机制研究

[学位论文] 李晓菲中国农业科学院 2016年硕士导师: 吕林共50页

摘要 : 本论文研究共设2个试验，采用体内原位结扎灌注肠段法和自然饲喂法，研究不同络（螯）合强度有机铁和无机硫酸亚铁在肉仔鸡小肠中的吸收特点及其机制。试验一采用原位结扎灌注肠段法研究不同形态铁在肉仔鸡小肠中的吸收特点。本试验又分为两个小... 展开本论文研究共设2个试验，采用体内原位结扎灌注肠段法和自然饲喂法，研究不同络（螯）合强度有机铁和无机硫酸亚铁在肉仔鸡小肠中的吸收特点及其机制。试验一采用原位结扎灌注肠段法研究不同形态铁在肉仔鸡小肠中的吸收特点。本试验又分为两个小试验：试验1和试验2。试验1采用单因子完全随机设计，共设8个处理组，分别为不加铁的空白对照组以及分别添加无机硫酸亚铁、甘氨酸铁、硫酸亚铁与甘氨酸混合物、硫酸亚铁与蛋氨酸混合物、弱络合强度（Qf=1.37）蛋氨酸铁（Fe-Met W）、中等络合强度（Qf=43.6）蛋白铁（Fe-Pro M）和极强螯合强度（Qf=8.59×103）蛋白铁（Fe-Pro ES）的处理组，添加铁组的铁灌注浓度为0.45 mmol/L，灌注时间30min。试验2采用4×6+1双因子完全随机设计，共设25个处理组，4种铁源分别为无机硫酸亚铁、Fe-Met W、Fe-Pro M和Fe-Pro ES，6个铁添加水平分别为6.25μg/ml(0.11mM）、12.5μg/ml(0.22 mM)、25μg/ml(0.45 mM)、50μg/ml(0.9 mM)、100μg/ml(1.79 mM)和200μg/ml(3.58 mM)，同时设置不加铁的空白对照组，灌注时间30min。试验1结果表明：在十二指肠中无论是有机铁还是无机铁的铁吸收均显著高于空肠和回肠中的铁吸收，是后者的1.35-2.8倍；不同处理组肉仔鸡在小肠各段的铁吸收均无显著差异。试验2结果表明：（1）灌注浓度为3.58mM时，中等络合强度铁（Fe-Pro M）和极强螯合强度铁（Fe-Pro ES）在肉仔鸡十二指肠中的吸收速率显著高于弱络合强度铁（Fe-Pro W）和无机硫酸亚铁；（2）对不同形态铁吸收速率随其铁添加水平的变化趋势进行拟合，发现不同铁源在肉仔鸡十二指肠中的吸收动力学模型均为饱和载体吸收；（3）对吸收动力学模型的参数进行比较，中等络合强度有机铁（Fe-Pro M）和极强螯合强度有机铁（Fe-Pro ES）的Jmax和Km均显著高于弱络合强度有机铁（Fe-Pro W）和无机硫酸亚铁。结果表明，肉仔鸡小肠吸收铁的主要肠段是十二指肠，不同铁源在肉仔鸡十二指肠中的吸收动力学模型均以饱和载体吸收为主；在小肠灌注铁浓度较高时，中等和极强络（螯）合强度有机铁的铁吸收显著高于弱络合强度有机铁和无机硫酸亚铁；将蛋氨酸或甘氨酸与硫酸亚铁简单混合不能改善小肠铁的吸收。试验二采用自然饲喂法研究了不同形态铁对肉仔鸡肝门静脉血浆铁含量及其小肠中铁转运载体DMT1和FPN1基因表达的影响，探讨不同形态铁的吸收差异及其机制。600只1日龄商品代Arbor Acres（AA）肉公雏于1-7日龄统一饲喂铁缺乏的葡萄糖-酪蛋白纯合饲粮（实测铁含量为3.26mg/kg），使肉仔鸡处于临界缺铁状态。于8日龄时，按平均体重从中选取480只鸡，随机分成5个处理组，每个处理组8个重复，每个重复12只鸡，分别饲喂对照组（不添加铁水平，实测铁含量为69.86 mg/kg）和添加60 mg/kg铁分别源于无机硫酸亚铁、Fe-Met W、Fe-Pro M和Fe-Pro ES的饲粮，试验期14天。试验结果表明：(1)在试验的第7天(14日龄)，肝门静脉血浆铁含量各处理组之间没有显著差异。在试验的第14天（21日龄），添加铁组的肝门静脉血浆铁含量显著高于对照组，且中等络合强度有机铁组的肝门静脉血浆铁含量和极强螯合强度有机铁组差异不显著，但是均显著高于弱络合强度有机铁组和无机硫酸亚铁组。（2）十二指肠中二价金属转运蛋白1（DMT1）和膜铁转运蛋白1（FPN1）的 mRNA和蛋白表达水平均显著高于空肠和回肠；与不添加铁的对照组相比，饲粮添加铁均显著降低肉仔鸡十二指肠的DMT1和FPN1 mRNA表达水平，而添加不同铁源组之间的小肠各段的DMT1和FPN1 mRNA和蛋白表达水平差异不显著。以上结果表明：十二指肠是肉仔鸡小肠DMT1和FPN1基因表达的主要部位，可能是试验一获得的十二指肠是肉鸡小肠铁吸收主要部位及其铁吸收主要是载体转运方式的重要原因；肉鸡小肠对中等络合强度有机铁和极强螯合强度有机铁的吸收显著高于弱络合强度有机铁和无机硫酸亚铁，铁转运载体DMT1和FPN1可能参与调节铁的吸收。综上所述，肉仔鸡小肠铁吸收的主要部位是十二指肠；不同铁源在肉仔鸡十二指肠中的吸收方式主要为饱和载体吸收方式；十二指肠是肉仔鸡小肠DMT1和FPN1基因表达的主要部位，可能是十二指肠是肉鸡小肠铁吸收主要部位及其铁吸收主要是载体转运方式的重要原因；中等络合强度有机铁和极强螯合强度有机铁在肉鸡小肠中的吸收显著高于弱络合强度有机铁和无机硫酸亚铁，铁转运载体DMT1和FPN1可能参与调节铁的吸收。收起

关键词 : 膜铁转运蛋白基因表达肉仔鸡吸收特点

8. CD24在宫颈癌中的表达及临床意义

[学位论文] 卢燕群广西医科大学 2015年硕士导师: 陈昌益共43页

摘要 : 目的:通过检测CD24蛋白在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中的表达，分析其在宫颈癌的临床意义，为宫颈癌的诊断和治疗提供一种新的有效指标。方法:采用免疫组化SP方法检测CD24在宫颈癌（40例）、宫颈上皮内瘤变（35例）及正常宫颈组织CD... 展开

关键词 : 宫颈癌临床诊断膜糖蛋白基因表达

9. Leptin对鸡胚卵黄膜和尿囊膜基因表达及血管形成的影响

[学位论文] 饶开晴南京农业大学 2009年博士导师: 赵茹茜共111页

摘要 : 本研究首先发现狼山母鸡蛋白限饲导致子代胚胎发育迟缓，出雏重降低，同时种蛋中瘦素（leptin）沉积减少，卵黄膜上与激素信号传递相关的基因表达模式发生改变，因此推测leptin可能作为一种母源性信号物质，通过改变卵黄膜、尿囊膜激素信号传递和血管... 展开本研究首先发现狼山母鸡蛋白限饲导致子代胚胎发育迟缓，出雏重降低，同时种蛋中瘦素（leptin）沉积减少，卵黄膜上与激素信号传递相关的基因表达模式发生改变，因此推测leptin可能作为一种母源性信号物质，通过改变卵黄膜、尿囊膜激素信号传递和血管形成相关基因的表达和尿囊膜血管的形成，影响鸡胚胎发育。为验证这一假说，我们分别在肉鸡和蛋鸡种蛋内注射leptin，观察其对不同品种的鸡胚重和出雏重的影响，同时检测卵黄膜和尿囊膜上相关基因的表达以及尿囊膜血管形成的变化；为进一步研究leptin对尿囊膜血管形成的影响，我们通过在尿囊膜上直接滴加leptin，以及在蛋鸡鸡胚尿囊膜上皮细胞体外培养体系中加入leptin，来深入研究leptin对尿囊膜血管形成相关基因及其蛋白表达的影响，为揭示母源性leptin影响禽类胚胎生长发育的机制提供实验证据。 1狼山母鸡蛋白限饲对蛋内激素沉积和卵黄膜基因表达以及子代出雏重的影响选取44周龄狼山鸡种母鸡（扬州家禽研究所）120羽，随机分成两个组，对照组饲喂粗蛋白水平为15%的日粮，试验组（低蛋白组）饲喂粗蛋白水平为10%的日粮．收集种蛋，部分用于测定卵黄中leptin和皮质酮水平，其余在相同的标准条件下孵化，在14胚龄时各组选取10只鸡胚称重并采样，其余鸡胚继续孵化，记录出雏重．采用实时荧光RT-PCR定量卵黄膜、尿囊膜相关基因表达，结果显示：与对照组相比，低蛋白组母鸡种蛋中沉积的leptin含量显著减少(P＜0.05)，而皮质酮含量没有显著变化(P＞0.05)；低蛋白组14胚龄胚重差异不显著(P＞0.05)，但出雏重显著低于对照组（P＜0.05）；卵黄膜上与皮质酮代谢相关的酶20-羟类固醇脱氢酶(20-hydroxysteroid dehydrogenase,20HSD)及血管发生相关的碱性成纤维细胞生长因子2（basic fibroblast growth factor2,FGF2）mRNA表达显著下调（P＜0.05），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）mRNA的表达明显下调(P=0.052)，与瘦素转运相关的瘦素受体（leptin receptor，LepR）、甲状腺素转运相关的甲状腺素运载蛋白（transthyretin，TTR）mRNA的表达与对照组相比没有显著差异(P＞0.05)；尿囊膜上的20HSD、VEGF、FGF2、LepRmRNA表达也无显著变化（P＞0.05）。以上结果提示：leptin可能作为种蛋中的信号物质改变胚膜相关基因的表达模式，影响鸡胚胎发育。 2蛋内注射leptin对蛋鸡和肉鸡出雏重、尿囊膜血管形成以及胚外膜相关基因表达的影响为研究leptin对不同品种鸡胚胎发育和尿囊膜血管形成的影响，本实验分别将莱航蛋鸡和罗斯肉鸡种蛋随机分为两组，对照组于入孵前在蛋清内注射100μL溶剂(PBS),试验组注射相同体积的0.5μg重组小鼠leptin。于12胚龄称重、测量胚长，同时采样用于mRNA的测定，出雏当天（0日龄）称重。在13胚龄时开窗，用等量的甲醇和丙酮固定尿囊膜，将尿囊膜置于显微镜下(×40)观察，随机选取相同面积的十个区域，观察拍照，用专业图象分析软件(Image-proplus4.5)计算血管的面积。结果显示，与对照组相比，leptin处理组蛋鸡和肉鸡12胚龄胚重、胚长和肉鸡的出雏重都无显著差异（P＞0.05），但蛋鸡出雏重显著降低(P＜0.05)，且只表现在雌性；同时雌性蛋鸡的尿囊膜血管面积显著减少(P=0.037,P＜0.05)，而对雄性无显著影响；肉鸡不论性别尿囊膜血管面积都无显著变化（P＞0.05）。与对照组相比，leptin处理显著上调雌性蛋鸡尿囊膜VEGF、LepR和20HSD的mRNA表达，FGF2mRNA表达有上调趋势(P=0.071)，而雄性尿囊膜只有20HSDmRNA表达显著上调(P＜0.05)；雌性蛋鸡卵黄膜VEGFmRNA表达显著上调(P＜0.05)，雄性的基因表达均无显著变化(P＞0.05)。与对照组相比，肉鸡尿囊膜LepR、20HSD、VEGF、FGF2mRNA表达均无显著差异(P＞0.05)： leptin处理显著上调了雄性肉鸡卵黄膜的LepR、VEGFmRNA表达，对20HSD、FGF2mRNA表达无显著影响（P＞0.05），雌性卵黄膜基因表达均无显著变化．以上结果提示：leptin对鸡胚发育、尿囊膜血管形成以及胚外膜基因表达的影响具有品种和性别特异性．蛋鸡尿囊膜基因表达模式的改变和血管生成的变化与蛋鸡出雏重降低相关联。 3 Leptin对鸡胚尿囊膜血管形成的影响及其机制为了进一步研究leptin对鸡胚尿囊膜血管形成的影响，在7胚龄时给鸡胚开窗，第8d在开窗处尿囊膜上放置一个3～4mm直径的明胶海绵，上面分别滴加2.5pL含0、10、100ngleptin的PBS溶液，2d后观察载体周围血管生成的数量变化情况。同时挑选12胚龄莱航蛋鸡鸡胚，分离尿囊膜，培养尿囊膜上皮细胞，分为四组：对照组(PBS)和leptin处理组（1ng/mL,10ng/mL、100ng/mL）．每天换液给予leptin处理，于72h收集细胞，提取细胞RNA和蛋白。实时荧光RT-PCR定量尿囊膜细胞上LepR、20HSD、VEGF、FGF2mRNA基因表达，用Western blot测定LepR、VEGF的蛋白含量。结果显示：与对照组相比，滴加10ngleptin，蛋鸡尿囊膜中血管及血管总数明显减少(P=0.054，P=0.064)，而小血管和大血管数无显著变化；雌性蛋鸡的中血管、大血管与血管总数均显著下降（P=0.011，P=0.014,P=0.044），对雄性来说不论大、中、小血管及血管总数均无显著变化；100ng leptin处理蛋鸡尿囊膜和10ng leptin处理肉鸡尿囊膜，不论性别，对各类血管均无显著影响。体外培养结果显示，三个剂量的leptin处理24h和48h均不影响细胞的相对活性，但处理72h显著抑制细胞的相对活性，并且浓度越高抑制效果越强，呈现明显的剂量效应。10、100ng/mL leptin显著上调尿囊膜上皮细胞LepRmRNA表达（P＜0.05），但LepR蛋白水平反而出现显著下降（10ng/mL，P=0.029）或下降趋势(100ng/mL，P=0.078)。三个剂量的leptin处理均显著上调VEGF、FGF2mRNA表达(P＜0.05)，但10和100ng/mL leptin处理的细胞VEGF蛋白水平呈现下调的趋势(P=0.065,P=0.07)。以上结果提示：胚胎期开窗直接给予10ng leptin，主要影响雌性蛋鸡尿囊膜上血管的形成，其机制可能与leptin显著抑制体外培养的尿囊膜细胞的活性，降低VEGF蛋白水平有关．收起

关键词 : 瘦素鸡胚卵黄膜尿囊膜基因表达血管形成

10. 靶向GP73的CAR-γδT细胞的构建

[学位论文] 曹郝佩广西医科大学 2020年硕士导师: 赵永祥共98页

摘要 : 背景：近年来，肿瘤的免疫疗法越来越受到人们的重视。其中，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和免疫检查点抑制剂型抗体为代表的肿瘤免疫治疗技术所表现出的巨大潜力和优势，给更多的肿瘤患者带来了希望。嵌合抗原受体的T细胞（也称为CAR-T细胞）是工程化... 展开背景：近年来，肿瘤的免疫疗法越来越受到人们的重视。其中，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和免疫检查点抑制剂型抗体为代表的肿瘤免疫治疗技术所表现出的巨大潜力和优势，给更多的肿瘤患者带来了希望。嵌合抗原受体的T细胞（也称为CAR-T细胞）是工程化的T细胞，使其表达能够靶向识别肿瘤相关抗原的单链抗体，从而更有效地靶向和破坏癌细胞。PD-1（程序性死亡受体1）是一种重要的免疫抑制分子，它存在于T细胞表面，肿瘤表面高表达PD-1的配体（PD-L1和PD-L2），其配体与T细胞的PD-1的结合，可导致T细胞的程序化死亡，从而使得肿瘤细胞逃避免疫系统的监视攻击。 T细胞受体（TCR）是一个固定在细胞膜上的异源二聚体，由两个不同的亚基所构成。95%的T细胞的受体由高度易变的α亚基和β亚基通过二硫键连结构成。这一类T细胞被称为αβT细胞。另外5%的T细胞受体含有γ亚基和δ亚基，这群T细胞被称为γδT细胞，主要分布在皮肤和黏膜组织。γδT细胞不仅对肿瘤细胞具有毒性作用，更独特之处在于它可以直接识别抗原，而不需抗原提呈细胞（APC）的提呈。高尔基体驻膜糖蛋白73(GP73)，也被称为高尔基体膜蛋白I（GOLM1）或高尔基体磷蛋白2(GOLPH2)，是位于高尔基体上的Ⅱ型跨膜糖蛋白。GP73在肝癌癌症组织中高表达，是一个重要的肿瘤标志物。目的：本课题旨在探索一种诱导分化培养高纯度的γδT细胞的方法，并将GP73单链抗体、PD-1免疫检查点阻断以及γδT细胞三联合，探索构建靶向GP73的CAR-γδT细胞的方法，并探讨PD-1--GP73CAR-γδT细胞体外增殖活性，为探索PD-1--GP73CAR-γδT细胞对肝癌的杀伤作用打下基础，为肝癌的免疫治疗提供新策略方法。方法：1、使用间接免疫荧光和流式细胞术检测肝癌细胞系（HepG2、SMMC-7721、MHCC97H）中GP73的表达情况；使用裸鼠构建不同肝癌细胞系（HepG2、SMMC-7721、MHCC97H）的同种异体肿瘤模型，通过免疫组化实验检测GP73的在不同肝癌组织中GP73的表达情况。2、在北京可瑞公司构建含GP73CAR的Donor质粒：（1）合成GP73特异性scFv序列；（2）将CD8引导区（leadsequence）、scFv序列、CD8铰链区（CD8hinge）、CD8跨膜区、CD28胞内区、4-1BB胞内区和人CD3ζ链胞内区串联拼接，形成三代CAR的功能序列后，插入EF-1a启动子之后；（3）为了监测CAR的敲入和表达效率，在CD3ζ序列后，使用T2A序列串联mCherry；（4）基于非同源重组末端插入技术（homology-independenttargetedintegration，HITI）构建CRISPRknockin的供体质粒，在CAR-mCherry的片段两侧联入PD1sgRNA或者AAVS1sgRNA的靶序（sgRNA+PAM）；（5）将上述PD1sgRNA-EF1α-GP73-CAR-T2A-mCherry-PD1sgRNA片段和AAVS1sgRNA-EF1α-GP73-CAR-T2A-mCherry-AAVS1sgRNA片段分别克隆至Donor质粒，构建成PD-1--GP73CAR和AAVS1--GP73CAR。3、γδT细胞的诱导与增殖。抽取健康志愿者的外周血，从中分离出外周血单个核细胞（PBMC），并用适量浓度的唑来膦酸（zol）、IL-2和IL-15刺激PBMC中的T细胞，使其诱导分化增殖成为γδT细胞，并用流式细胞仪检测γδT细胞的纯度。4、将PD-1--GP73CAR、AAVS1--GP73CAR和GFP阳参质粒三种质粒，每种质粒再配合Cas9蛋白和其相应的PD-1sgRNA或AAVS1sgRNA，分别电穿孔转染至γδT细胞中，得到PD-1--GP73CAR-γδT细胞、AAVS1--GP73CAR-γδT细胞和GFP-γδT细胞，在荧光显微镜下观察转染后的γδT细胞的Cherry或GFP荧光表达情况，并使用流式细胞仪检测它们各自对应的荧光表达率。5、GP73CAR-γδT细胞与MHCC97H细胞的体外共培养，ELISA试剂盒检测其分泌IFN-γ和TNF-α两种细胞因子含量。结果：1、MHCC97H细胞中GP73的表达率明显高于HepG2、SMMC-7721两种肝癌细胞。2、流式细胞术结果显示PBMC经刺激培养，γδT细胞的纯度可达到84.9%，这表明适量的唑来膦酸（zol）、IL-2和IL-15可诱导T细胞分化成为γδT细胞，并使其大量增殖。3、电穿孔转染后的PD-1--GP73CAR-γδT细胞、AAVS1--GP73CAR-γδT细胞在荧光显微镜可观察红色荧光，GFP-γδT细胞可观察到绿色荧光。流式细胞术结果显示PD-1--GP73CAR-γδT细胞和AAVS1--GP73CAR-γδT细胞的Cherry的表达分别为7.8%和19.9%。4、与MHCC97H细胞共培养后，PD-1--GP73CAR-γδT细胞、AAVS1--GP73CAR-γδT细胞、PD-1--γδT细胞和γδT细胞四组细胞分泌的IFN-γ和TNF-α两种细胞因子含量依次递减。结论：1、本课题证明了GP73蛋白在肝癌细胞系MHCC97H中高表达，因此MHCC97H细胞可作为本课题中所构建的GP73CAR-γδT的良好靶标细胞。2、成功构建出了靶向GP73的PD-1位点敲除的CAR-γδT细胞和靶向GP73的AAVS1位点敲除的CAR-γδT细胞，即PD-1--GP73CAR-γδT细胞和AAVS1--GP73CAR-γδT细胞。3、PD-1位点敲除和GP73单链抗体均能促使CARγδT细胞分泌更多的IFN-γ和TNF-α细胞因子。4、GP73单链抗体、PD-1免疫检查点阻断以及γδT细胞的三联合，为肝癌的免疫治疗提供了新的策略。收起

关键词 : 肝癌高尔基体驻膜糖蛋白73 &gamma &delta T细胞蛋白表达