摘要: 对虾是中国一种重要水产养殖经济品种，但各种对虾病毒病的频繁爆发严重制约了对虾养殖业的健康发展，造成了巨大的经济损失。而对虾永生性细胞系的建立将会为对虾病毒的致病机理研究以及抗病毒疫苗的研发提供一种不可或缺的有力研究工具。近30年来，... 展开 对虾是中国一种重要水产养殖经济品种，但各种对虾病毒病的频繁爆发严重制约了对虾养殖业的健康发展，造成了巨大的经济损失。而对虾永生性细胞系的建立将会为对虾病毒的致病机理研究以及抗病毒疫苗的研发提供一种不可或缺的有力研究工具。近30年来，各国学者虽然在建立对虾细胞系方面进行了许多尝试和探索，但对虾永生性细胞系一直未能成功建立。通过永生性转化相关基因的过表达已经成功建立了许多哺乳动物细胞系。但由于体外培养对虾细胞存在分裂停滞的问题，导致核酸水平上的各种基因转染方法，在不分裂的对虾细胞中得到的基因表达效率都极低，因而难以实现对虾细胞的诱导转化。细胞穿膜肽具有携带大分子物质穿透细胞膜这一特性，因此，设计并筛选出有效的对虾细胞穿膜肽，并将其用于携带永生性转化相关的功能蛋白进入对虾细胞，则可以解决上述问题，为对虾细胞的永生性转化奠定技术基础。 本文首先设计了以下三种类型细胞穿膜肽：①阳离子细胞穿膜肽11R，由11个精氨酸组成；②对虾细胞特异性的疏水性穿膜肽HP（Hydrophobicpenetratingpeptide），由16个疏水性氨基酸组成，序列组成为AILAITAVIAVFIVIF，选自对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28的疏水区域第12-27个氨基酸；③对虾细胞特异性的两亲性穿膜肽AP（Amphotericcellpenetratingpeptide），由疏水性细胞穿透肽HP与核定位信号RTRKRKNSE相连而成，核定位信号取自对虾细胞周期蛋白E(CyclinE)的第23-31个氨基酸，其序列组成为AILAITAVIAVFIVIF-RTRKRKNSE。 其次，以eGFP为报告基因，先后成功构建了上述三种类型细胞穿膜肽的原核表达载体：pET30a-11R-eGFP、pET30a-AP-eGFP和pET30a-HP-eGFP，以不含有穿膜肽的pET30a-eGFP作为对照。然后，将以上四种原核表达质粒在大肠杆菌细胞Transetta（DE3）中进行原核表达，并利用pET30a表达载体中融合表达的6×His标签，将表达产物过镍柱，分别纯化上述4种目的蛋白。结果表明，成功原核表达了上述4种eGFP报告基因融合蛋白，纯化后蛋白的终浓度分别为：eGFP蛋白3mg/mL，11R-eGFP蛋白0.7mg/mL，HP-eGFP蛋白0.415mg/mL和AP-eGFP蛋白0.320mg/mL。 由于对虾细胞目前没有建立起永生性细胞系，只能进行原代培养，获得大量单层细胞困难，所以利用与对虾细胞亲缘关系较近的昆虫sf9细胞，以eGFP蛋白为阴性对照，筛选穿膜肽11R-eGFP在昆虫sf9细胞中的最佳蛋白添加浓度和最佳孵育时间。结果表明，11R-eGFP蛋白可成功穿膜进入sf9细胞，而eGFP蛋白则不能穿膜进入sf9细胞；在所测试的三个浓度2.5、5和10μM中，以5μM为最佳孵育浓度；在0.25-6h的孵育时间内，4h为最佳孵育时间。因此，11R-eGFP在昆虫sf9细胞中的最佳孵育条件为：孵育浓度为5μM，孵育时间为4h时，细胞穿膜肽11R的穿膜效率最高。经ImageJ软件统计分析可知，11R-eGFP的穿膜效率可达72％。激光共聚焦荧光显微镜观察结果进一步验证了细胞穿膜肽11R可以携带eGFP穿膜进入昆虫sf9细胞内部。 穿膜肽11R-eGFP在对虾体外培养细胞中的穿膜效果分析表明，11R-eGFP蛋白也可以成功穿膜进入对虾细胞；5μM的11R-eGFP蛋白孵育体外培养的对虾血淋巴细胞和胚胎细胞4h后的穿膜效率，分别可达70％和10％左右。激光共聚焦显微镜观察也验证了穿膜肽11R可以携带eGFP穿膜进入对虾血淋巴细胞和对虾胚胎细胞内部。 疏水性穿膜肽HP-eGFP和两亲性穿膜肽AP-eGFP在昆虫sf9细胞中的穿膜效果分析表明，将5μM的HP-eGFP和AP-eGFP两种蛋白分别孵育昆虫sf9细胞4h后，在荧光显微镜下可观察到弱的绿色荧光。DAPI染色和激光共聚焦荧光显微镜观察结果表明，细胞穿膜肽HP和AP可以携带eGFP蛋白进入昆虫sf9细胞，但是穿膜效率较低。将5μM的HP-eGFP和AP-eGFP两种蛋白分别孵育原代培养的对虾血淋巴细胞4h后，也仅观察到弱的绿色荧光。DAPI染色后于激光共聚焦显微镜扫描可知，细胞穿膜肽HP和AP可以携带eGFP蛋白进入对虾血淋巴细胞。细胞穿膜肽HP和AP在sf9细胞和对虾血淋巴细胞中的穿膜效果明显低于11R穿膜肽，这可能与HP-eGFP和AP-eGFP两种蛋白的浓度远低于11R-eGFP有关。 Survivin基因的编码区大小为420bp，含有一个BIR结构域，它是少数既能控制细胞周期，又能抑制细胞凋亡的因子。又由于真核表达系统所表达出的蛋白更接近于天然蛋白。基于此，本文又构建了穿膜肽11R的真核融合表达载体pCDNA-11R-survivin-EK。其N端含有11R的细胞穿膜肽，下游引物去掉了终止密码子，并在其羧基端添加肠肽酶（Enterokinase，EK）识别位点（-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-)，以便于后续对组氨酸标签的切除。将pCDNA-11R-survivin-EK转染到哺乳动细胞293T细胞中进行过表达，镍柱纯化表达产物，并未成功得到目的蛋白。而后又构建了穿膜肽11R的原核融合表达载体pET30a-11R-survivin-EK，并成功诱导表达和纯化得到0.174mg/mL的目的蛋白。将重组蛋白11R-survivin-EK按照5μM的最优浓度添加于对虾血淋巴原代培养基中，孵育3h后观察到初步的转化特征，即细胞开始回缩，6h后血淋巴细胞由伸展的长梭形变成圆形，贴壁不紧，易脱落，并悬浮生长。为提高11R-survivin蛋白的永生性转化效果，今后还需要进一步优化原核表达条件，提高该蛋白的表达丰度。 以上研究结果为今后利用永生性转化蛋白诱导对虾细胞永生化转化奠定技术基础。 收起