摘要: 牛副流感病毒3型(Bovineparainfluenzavirus3,BPIV3)是引起犊牛和成年牛呼吸道病的重要病原之一，常与多种细菌、病毒等混合感染，形成牛呼吸道疾病综合征(Bovinerespiratorydiseasecomplex,BRDC)。BPIV3在我国牛群中广泛流行，尚无有效的抗病毒药物。... 展开 牛副流感病毒3型(Bovineparainfluenzavirus3,BPIV3)是引起犊牛和成年牛呼吸道病的重要病原之一，常与多种细菌、病毒等混合感染，形成牛呼吸道疾病综合征(Bovinerespiratorydiseasecomplex,BRDC)。BPIV3在我国牛群中广泛流行，尚无有效的抗病毒药物。BPIV3的流行和感染给中国乃至世界范围内的养牛业造成巨大经济损失，对该病的防控和其致病机制的研究至关重要。有研究证实BPIV3可能利用IL10及其重要的下游产物SOCS3(Suppressorofcytokinesignaling3,SOCS3)下调宿主的抗感染免疫应答。因此，阐明SOCS3在BPIV3感染中的作用并建立急性感染模型对解析其致病机制及防控奠定了研究基础。 本研究首先利用原核表达系统获得mScarlet和TAT-mScarlet重组蛋白，对重组蛋白的表达条件进行优化。随后，利用mScarlet重组蛋白免疫新西兰兔，制备mScarlet的特异性多克隆抗体，Westernblot结果表明制备的多克隆抗体能识别重组蛋白TAT-mScarlet、CTP-mScarlet和mScarlet。CCK-8试验表明TAT-mScarlet重组蛋白在浓度≤0.2mg/mL时对MDBK、MDCK、HEK-293和Hela细胞均没有细胞毒性。将TAT-mScarlet重组蛋白分别加入到MDBK、MDCK、HEK-293和Hela细胞的培养基中，与细胞进行共孵育，并利用Westernblot和免疫荧光检测细胞内TAT-mScarlet重组蛋白的转导量，结果表明重组蛋白TAT-mScarlet具有跨膜转导的功能，且转导效率在一定的范围内具有剂量和时间依赖性。该研究证实TAT-mScarlet重组蛋白具有转导至真核细胞的功能，解决了现存MDBK细胞转染效率较低的问题。 我们进一步验证了融合蛋白TAT-mScarlet-SOCS3和mScarlet-SOCS3-TAT的跨膜功能，确保TAT能介导SOCS3蛋白进入细胞内发挥作用。鉴于SOCS3可以通过负反馈调节方式抑制Ⅰ型干扰素依赖的抗病毒信号通路，推测SOCS3可能与协助BPIV3逃避宿主的免疫反应相关，因此本研究主要探索SOCS3在BPIV3感染中的作用。首先通过建立小鼠肺部感染模型，利用qPCR检测试验中各组小鼠肺脏组织中BPIV3的病毒载量，证明在体内动物试验中TAT介导的SOCS3蛋白能发挥促进BPIV3增殖的作用;其次，在细胞水平上通过检测BPIV3病毒滴度，进一步阐明TAT介导的SOCS3融合蛋白具有跨膜转导进细胞及促进BPIV3增殖的功能。为了验证SOCS3是否能够抑制抗病毒信号通路，通过在细胞内转导牛SOCS3蛋白后，加入BoIFNβ激活JAK/STAT信号通路，检测STAT1和STAT3蛋白的磷酸化水平及Mx1蛋白的表达情况。研究结果显示，SOCS3可以通过抑制STAT1和STAT3蛋白的磷酸化阻碍干扰素信号的传递，并引起Mx1抗病毒基因的表达下调。 综上所述，本研究证明重组蛋白TAT-mScarlet具有跨膜转导功能，并以此为研究基础制备融合牛SOCS3基因的融合蛋白，通过小鼠肺部感染试验和细胞试验进一步证明TAT介导的SOCS3蛋白可以促进BPIV3增殖。在细胞水平上验证牛SOCS3蛋白能够抑制STAT1和STAT3蛋白的磷酸化阻碍干扰素信号的传递，并引起Mx1抗病毒基因的表达下调。本研究为生物大分子进入细胞制备了跨膜递送系统，为递送治疗性药物及解析动物致病机制提供研究基础。 收起