摘要: 牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza3virus，BPIV3)是引起犊牛呼吸道感染的重要病原体之一，世界各国的牛群感染BPIV3的抗体阳性率通常在50％到90％之间。BPIV3可感染肺上皮细胞与肺泡巨噬细胞，发生组织损伤和免疫抑制，随后继发细菌感染导致严重... 展开 牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza3virus，BPIV3)是引起犊牛呼吸道感染的重要病原体之一，世界各国的牛群感染BPIV3的抗体阳性率通常在50％到90％之间。BPIV3可感染肺上皮细胞与肺泡巨噬细胞，发生组织损伤和免疫抑制，随后继发细菌感染导致严重的支气管肺炎。IL10（Interleukin10，IL10）是极少数具有强大的负调节功能的抗炎性细胞因子，上皮细胞、单核巨噬细胞等都是IL10发挥抑制性作用的靶细胞。许多病毒感染后依靠多种途径诱导宿主IL10表达来负调控宿主免疫应答，IL10负调控免疫应答的相关机制在HIV（Human immunodeficiency virus）、FMDV（Foot-and-Mouth disease virus）、LCMV（Lymphocytic choroid meningitis virus）、PCV2（Porcine circovirus type2）、PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）等病毒的致病机制中发挥重要作用，BPIV3感染中IL10是否及如何调控免疫应答尚未清楚。 本研究分离BPIV3流行毒株并分析其致病特征，证实BPIV3流行株能够感染牛与鼠的上皮细胞与单核巨噬细胞。建立小鼠呼吸道感染模型与鼠原代巨噬细胞感染模型。以小鼠与原代巨噬细胞的高通量转录组数据证实BPIV3可能利用IL10及其重要的下游产物SOCS3（Suppressor of cytokine signaling3，SOCS3）下调宿主的抗感染免疫应答。随后开展了牛IL10、IL10R1、SOCS3的生物学活性与作用机制研究，证实牛IL10与IL10受体结合转导信号，激活JAK-STAT3通路来迅速高表达SOCS3，在小鼠与牛细胞上都具有类似的生物学活性。最终探索了BPIV3主要依赖MyD88、p38MAPK以及NF-κB信号通路来表达IL10，负调控宿主抗病毒应答并提高BPIV3复制能力的相关机制。本研究为阐明IL10/STAT3/SOCS3信号轴在BPIV3感染中的致病作用和抑制IL10通路防制牛呼吸道传染病奠定了理论基础。 首先对2017年黑龙江省、河北省等地的群发犊牛肺炎1793份血清进行了BPIV3的抗体调查，结果表明近70%的犊牛呼吸道疾病可部分归因于BPIV3所参与的感染。随后自病牛鼻拭子中分离到了一株BPIV3，其具有感染MDBK、BHK21、BBEC、BL、BTB、BT、ML、PBMC、BMDM等牛与小鼠多种上皮细胞与单核巨噬细胞的能力。分离株经呼吸道感染小鼠肺脏并对其进行了致病性的分析，感染鼠肺脏发生病理变化，并且肺内病毒在12d内不能够被完全清除，感染肺脏发生了多种炎性因子的表达，检测到重要的调节性抑炎性因子IL10在感染后的12d之内，大多数检测时间点的转录均显著高于对照。 通过高通量转录组测序、差异表达分析与基因富集及蛋白质相互作用网络分析，在小鼠与原代巨噬细胞感染BPIV3前后重要宿主免疫与调控分子的变化模式。BPIV3感染小鼠与感染巨噬细胞后，在感染早期显著上调了IL10与SOCS3表达，SOCS3几乎在所有分组中都得到了显著的转录激活。大多数组别中Tyk2、STAT1、STAT2、IRF7、ISG15、Mx1、RSAD2、PML等关键抗感染免疫基因被显著下调，IL10与SOCS3参与了BPIV3感染后抑制宿主抗病毒应答。 为进一步研究牛IL10的信号转导以及其是否能发挥免疫负调控作用，克隆了牛IL10、牛IL10R1与SOCS3基因并分析其生物信息与进化保守性。对IL10、IL10R1胞外区与SOCS3进行了蛋白表达与纯化，并制备了相应的高效价抗体。采用腺病毒系统表达了牛IL10、IL10R1胞外区，然后在牛与鼠细胞上证实重组IL10可快速并强烈诱导SOCS3的表达，这种作用可以被IL10R1胞外区所抑制。IL10与SOCS3都具有抑制Ⅰ型干扰素及其下游分子表达的功能，即牛IL10与SOCS3可用于牛与鼠细胞的负免疫调控研究，而IL10R1胞外区可作为IL10通路的阻断剂。 进一步探讨BPIV3感染中IL10参与负调控的相关机制，研究表明BPIV3以时间与剂量依赖性的方式诱导原代巨噬细胞与肺上皮细胞在感染极早期迅速上调IL10的mRNA并大量分泌IL10蛋白，同时TNF-α与Ⅰ型干扰素及其下游蛋白Mx1的表达受到了显著的抑制。IL10在原代巨噬细胞中的产量远高于上皮细胞，外源与内源性的IL10都可提高BPIV3的滴度。IL10R1胞外区作为游离的受体竞争掉IL10或抑制剂阻断IL10产生的通路都能降低病毒的复制能力。在MyD88（Myeloid differentiation factor，MYD88）缺失与MyD88抑制剂处理的BMDM细胞上，IL10/SOCS3的表达大幅降低，表明依赖MyD88分子转导信号的通路在BPIV3感染过程中诱导IL10的表达起到了重要作用。此外，应用通路抑制剂证实NF-κB和p38MAPK在BPIV3诱导IL10表达中为关键通路。JAK-STAT通路中的多种JAK与STAT分子均参与IL10与BPIV3之间复杂的调控作用。 综上所述，BPIV3是我国犊牛传染性肺炎的主要病原之一，感染后可显著上调IL10与SOCS3的表达并引起宿主免疫抑制，主要下调以Ⅰ型干扰素及其下游分子介导的抗病毒应答，这种由IL10介导的负调控依赖于MyD88、NF-κB和p38MAPK信号通路。本研究可为进一步阐明BPIV3的分子致病机制与开发以调控IL10为靶标的免疫防控提供理论基础。 收起