中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

1. 人源唾液酸转移酶ST6GALNAC5与ST6GALNAC6的重组表达、酶学研究及应用

[学位论文] 金铭畅山东大学 2022年硕士导师: 曹鸿志；刘长城共143页

摘要 : 糖链是生物体内一类重要的生命物质，其多样的结构使得其在多种生命活动中起到丰富而重要的作用。了解糖链在生命活动中所发挥的作用，需要明确糖链结构与功能之间的构效关系。糖链的研究依赖于结构均一、明确的聚糖或糖缀合物。与蛋白质、核酸的生源... 展开糖链是生物体内一类重要的生命物质，其多样的结构使得其在多种生命活动中起到丰富而重要的作用。了解糖链在生命活动中所发挥的作用，需要明确糖链结构与功能之间的构效关系。糖链的研究依赖于结构均一、明确的聚糖或糖缀合物。与蛋白质、核酸的生源合成途径不同，糖链的生源合成是一个非模板驱动的过程，这一过程是由一系列的酶通过逐个添加单糖的方式来合成复杂的糖链。适用于糖链高效合成的糖基转移酶是糖链酶促合成的关键工具，也是推动阐明聚糖多样性和功能的关键要素。唾液酸是哺乳动物中常见的单糖结构单元，常存在于糖链的非还原末端，在细胞识别、信号传导等生命过程中发挥重要作用。由于唾液酸结构的复杂性，唾液酸糖苷键的立体选择性合成一直以来都是糖合成化学领域的一个难题，而利用唾液酸转移酶可以高效、立体专一地合成相应的唾液酸苷键。Siaα2，6GalNAc糖苷键一种较为常见的唾液酸连接方式。目前，常用于合成Siaα2，6GalNAc糖苷键的α2，6-唾液酸转移酶是来源于海洋美人鱼发光杆菌的Pd2，6ST，因其宽泛的底物适应性，在合成过程中容易产生难以分离纯化的副产物，极大的限制了其在唾液酸化糖链酶促合成中的应用。为了解决这个问题，增加可用于合成Siaα2，6GalNAc糖苷键的糖基转移酶的种类，本研究采用Sf9昆虫细胞表达系统对人源的唾液酸转移酶ST6GALNAC5和ST6GALNAC6进行了体外重组表达，获得了可应用于合成的唾液酸转移酶。对这两个酶的pH、温度和金属离子等酶学性质进行考察，找到了最适的酶促反应条件。利用酶法模块策略合成了一系列底物，通过体外实验探究其底物适应性，进一步验证其识别的结构特征;将其成功应用于双唾液酸化T抗原、神经节苷脂GD1α、GM1α和GalNAc-GD1α等复杂唾液酸化糖链的合成。为目前难以合成的Neu5Acα2，6GalNAc糖苷键的构建提供了新的解决途径。收起

关键词 : 唾液酸转移酶生物合成酶学性质底物适应性

2. β-半乳糖苷α-2,6唾液酸转移酶2的表达与乳腺癌的预后以及肿瘤进展的相关性研究

[学位论文] 程骏驰浙江大学 2016年博士导师: 范伟民共85页

摘要 : 乳腺癌是女性发病率第一位的肿瘤，也是女性中常见的肿瘤相关死因。乳腺癌的诊断治疗措施还不是非常令人满意，需要研究人员们去探索新的诊断或治疗的靶点。β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)是目前研究最为透彻的唾液酸转移酶之一，在包括乳... 展开乳腺癌是女性发病率第一位的肿瘤，也是女性中常见的肿瘤相关死因。乳腺癌的诊断治疗措施还不是非常令人满意，需要研究人员们去探索新的诊断或治疗的靶点。β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)是目前研究最为透彻的唾液酸转移酶之一，在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中均出现表达上调，且与肿瘤的进展和转移关系密切。作为ST6Gal1的同工酶，ST6Gal2在近年来被人发现。然而目前对ST6Gal2功能所知甚少，ST6Gal2对肿瘤进展的作用目前仍不清楚。为了研究ST6Gal2在乳腺癌中的作用，我们收集了40例乳腺癌临床标本和相应的癌旁正常乳腺组织。我们运用RT-PCR和免疫组化染色来研究ST6Gal2在肿瘤组织中的表达是否出现升高。我们接下来从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载了778例乳腺癌病人的基因表达谱和病人疾病特征的数据，并根据患者肿瘤的ST6Gal2表达水平将其分为两组:ST6Gal2高表达组和低表达组，用Fisher确切概率法比较其病理特征的差别:如病理分期，ER，PR，HER2表达水平，年龄等。此外，我们绘制了两组病人的生存率曲线，用对数秩和检验(Log-rank)统计了两组生存率的差异。随后我们选取了5珠乳腺癌细胞株，用Western Blot检测了它们ST6Gal2的表达水平，并在其中挑选了两组相对ST6Gal2高表达的细胞株进行后续实验。我们用siRNA沉默了两株细胞中ST6Gal2的表达，用RT-PCR检测了沉默的效果。然后用CCK-8和流式细胞仪检测了细胞的增值和周期变化，并用纤连蛋白包被的12孔板和Transwell实验检测了细胞的粘附和侵袭能力的变化。为了做进一步的机制研究，我们用前面从TCGA下载的基因表达谱数据，做基因富集分析(GSEA)来研究ST6Gal2的表达与粘附和转移相关的基因集中基因表达的相关性。并选取了具有代表性的促进侵袭的基因，用RT-PCR和Western Blot检测了ST6Gal2的沉默对这些基因表达的影响。我们通过RT-PCR和免疫组化发现，相比较正常组织，ST6Ga12的表达在肿瘤组织中升高。我们通过分析TCGA数据得出，ST6Gal2的高表达和年龄以及HER2的表达水平具有正相关性。重要的是，我们发现，ST6Gal2的高表达与乳腺癌的预后不佳显著相关。我们通过siRNA沉默两株乳腺癌细胞株ST6Gal2的表达，发现细胞的生长受到抑制，细胞出现G0/G1期周期阻滞，且细胞与基质的粘附和侵袭能力下降。GSEA分析结果显示，ST6Gal2的高表达与粘附和转移相关基因集中的基因的表达升高出现显著的相关性。进一步的Western Blot和RT-PCR表明，沉默ST6Gal2导致6个与转移和侵袭有关的基因:RhoA、TGF-β3、VEGFC、CTNNB1、FUT8以及WISP-1的表达下调。总之，我们的研究表明ST6Gal2的高表达可能导致肿瘤的进展并可能因此导致乳腺癌病人不佳的预后。我们的发现说明ST6Gal2有潜力成为一个预测乳腺癌预后的生物学标记或作为治疗的一个靶点。收起

关键词 : 乳腺癌预后评估唾液酸转移酶ST6Gal2 蛋白表达

3. 肿瘤细胞中gp96的唾液酸化差异研究

[学位论文] 梁延贵南开大学 2015年硕士导师: 张奇共66页

摘要 : 糖蛋白在真核生物的细胞活动中发挥着十分重要的作用，唾液酸通常是真核生物细胞最外层的单糖的糖脂和糖蛋白，而且它对真核生物细胞的生长发育起到十分重要的作用。内质网上的蛋白gp96在维持体内蛋白的平衡方面扮演着十分重要的角色。在本次研究中，... 展开糖蛋白在真核生物的细胞活动中发挥着十分重要的作用，唾液酸通常是真核生物细胞最外层的单糖的糖脂和糖蛋白，而且它对真核生物细胞的生长发育起到十分重要的作用。内质网上的蛋白gp96在维持体内蛋白的平衡方面扮演着十分重要的角色。在本次研究中，以叠氮标记的甘露糖进行细胞代谢，代谢后以叠氮化的唾液酸替代天然的唾液酸于细胞糖蛋白的糖链中呈现，随后通过含有炔基的生物素化试剂，依赖于点击化学方法，构建了糖蛋白的生物素-亲和素分离纯化体系，采用该体系富集纯化肿瘤细胞肺癌细胞A549、宫颈癌细胞Hela、胰腺癌细胞SW1990中的唾液酸化的糖蛋白。经HPLC-MS/MS分析发现在三种细胞系中均含有gp96蛋白，但含量存在显著差异。随后使用免疫印迹和实时定量PCR对全细胞的gp96进行定量分析。使用免疫印迹法检测分离的糖蛋白中gp96的含量。通过酶联免疫吸附反应分析gp96的生物素化和唾液酸修饰程度。确定了在三种肿瘤细胞中蛋白gp96的表达，并发现在gp96在细胞水平的表达无显著性差别，但是在胰腺癌细胞SW1990细胞中生物素化和唾液酸化后的gp96含量比宫颈癌细胞Hela、肺癌细胞A549的含量都要低。此外，在本课题中用唾液酸转移酶抗体ST3Gal和ST6Gal1进行进一步的免疫分析。结果显示Hela和A549细胞中唾液酸转移酶ST3Gal6和ST6Gal1的含量明显高于SW1990细胞，这和三种细胞中gp96唾液酸化差异是保持一致的。这个实验结果表明肿瘤细胞中唾液酸转移酶的含量的不同可能是肿瘤细胞中gp96唾液酸化程度不同的一个重要原因。综上，本课题发现在不同的肿瘤细胞中，gp96在唾液酸修饰上有明显差异，胰腺癌细胞SW1990中gp96的唾液酸化程度较低。并且这可能与肿瘤细胞中唾液酸转移酶的含量较低引起的。收起

关键词 : 点击化学肿瘤细胞 gp96蛋白唾液酸转移酶

4. ST6GalNAcⅡ在乳腺癌侵袭过程中的作用机制及表达的临床意义

[学位论文] 任栋梁大连医科大学 2015年硕士导师: 赵永福共43页

摘要 : 目的:研究唾液酸转移酶ST6GalNAcⅡ和PI3K/Akt-NFkB信号通路在乳腺癌细胞侵袭过程中的作用及分子机制，分析ST6GalNAcⅡ表达与乳腺癌临床特征的相关性，从而进一步明确新的乳腺癌诊断和治的靶向分子。方法:分别运用逆转录RT-PCR和western blot方... 展开目的:研究唾液酸转移酶ST6GalNAcⅡ和PI3K/Akt-NFkB信号通路在乳腺癌细胞侵袭过程中的作用及分子机制，分析ST6GalNAcⅡ表达与乳腺癌临床特征的相关性，从而进一步明确新的乳腺癌诊断和治的靶向分子。方法:分别运用逆转录RT-PCR和western blot方法研究ST6GalNAcⅡ在乳腺癌细胞系(人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7)中的基因和蛋白表达水平，并探究ST6GalNAcⅡ在乳腺癌细胞侵袭过程中的作用机制:(1)用蛋白印迹方法分析ST6GalNAcⅡ基因敲除（用shRNA）后ST6GalNAcⅡ蛋白表达情形，然后在ST6GalNAcⅡ基因敲除后，运用transwell侵袭实验，进一步研究乳腺癌肿瘤细胞体外侵袭能力。(2)购置45只5周大雌性裸鼠并分为3组，将ST6GalNAcⅡshRNA处理过的MDA-MB-231细胞注入到每只裸鼠的腋下，并用control-shRNA转染过的MDA-MB-231细胞和正常MDA-MB-231细胞组作为对照，喂养小鼠成瘤后，分离肿瘤，称重并拍照;免疫组化分析ST6GalNAcⅡ蛋白在小鼠成瘤中的表达及与乳腺癌侵袭的相关性。(3)用shRNA将ST6GalNAcⅡ基因沉默后，分析PI3K/Akt-NFkB信号分子的表达及活性差异;探寻抑制MDA-MB-231细胞中PI3K/Akt信号通路（通过用PI3K抑制剂LY294002和Akt siRNA来实现）后，PI3K/Akt-NFkB通路对MDA-MB-231细胞侵袭性的作用及分子机制。收集大连医科大学附属第二医院于2011年7月到2013年7月经手术治疗（患者术前术后都未行放化疗）的乳腺癌和癌旁组织标本各101例，于病案室收集这些患者详细的病历信息，并运用免疫组化方法来探讨ST6GalNAcⅡ蛋白表达与乳腺癌临床特征间的关系。结果:与低侵袭性MCF-7细胞系相比，ST6GalNAcⅡ在MDA-MB-231细胞系中具有更高的表达水平;MDA-MB-231细胞中ST6GalNAcⅡ基因沉默抑制了细胞在体外的侵袭性并抑制了MDA-MB-231细胞在裸鼠体内的成瘤性;shRNA抑制ST6GalNAcⅡ表达后，MDA-MB-231细胞中信号通路分子的磷酸化水平明显下降;用PI3K特异性抑制剂LY294002及Akt siRNA阻断PI3K/Akt信号通路，明显抑制NFkB的活性及MDA-MB-231细胞的侵袭性。ST6GalNAcⅡ蛋白表达水平与乳腺癌患者年龄、有无远处转移等因素之间没有关联(p＞0.05)，但与乳腺癌的组织病理学分级、淋巴结转移情况和临床分期有显著的相关性(P＜0.05)。结论:(1)ST6GalNAcⅡ在调节乳腺癌细胞侵袭性方面有至关重要的作用，而这一作用很可能是通过PI3K/Akt-NFkB信号通路实现的。(2)ST6GalNAcⅡ的表达异常与乳腺癌的组织病理学分级、淋巴结转移情况和临床分期关系密切。收起

关键词 : 乳腺癌唾液酸转移酶细胞侵袭分子机制

5. 基于生物信息学技术确定与肺腺癌预后相关的唾液酸转移酶基因的研究

[学位论文] 龙奕名中国科学院大学 2022年硕士导师: 黄锐敏共86页

摘要 : 肺癌是第二大最常见的癌症和死亡率最高的癌症，约占被诊断癌症的十分之一(11.4％)，占死亡人数的五分之一(18.0％)。在临床上，非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的85％，而肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)是非小细胞肺癌最... 展开肺癌是第二大最常见的癌症和死亡率最高的癌症，约占被诊断癌症的十分之一(11.4％)，占死亡人数的五分之一(18.0％)。在临床上，非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的85％，而肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)是非小细胞肺癌最常见的类型，占非小细胞肺癌患者的70％。“癌基因依赖性”的概念是指肿瘸细胞依赖于激活或过表达的癌基因的特异性活性。在肺癌中，主要的致癌驱动因素是EGFR和KRAS突变以及ALK重排，它们最常见于肺腺癌，为靶向治疗提供了优良的药物靶点。这些治疗方法提高了部分患者的生存率，但由于肿瘤异质性和肿瘤复发，肺腺癌患者总体治愈率并不乐观。因此，为肺腺癌患者探索新的生物标志物和药物靶点十分重要。糖基化是所有真核细胞中最丰富、最多样的蛋白质翻译后修饰。这些单糖或聚糖与蛋白质的特定氨基酸连接，参与调节细胞内的代谢途径和重要过程，如细胞-细胞相互作用和细胞粘附。异常糖基化常发生在恶性肿瘤中，并参与肿瘤的发生和转移。唾液酸修饰是由九个碳单糖组成的带负电荷的唾液酸主要通过唾液酸转移酶通过α2，3-，α2，6-和α2，8连接的末端糖修饰。唾液酸转移酶主要由四个家族组成:ST3GAL、ST6GAL、ST6GALNAC和ST8Sia。其中ST3GAL家族蛋白主要定位于高尔基体，负责α2，3-连接的特异性唾液酸转移催化反应。由于催化底物不同，将其分为六个成员ST3GAL1-6。肿瘤细胞糖基端高度异常的唾液酸化有助于信号转导和免疫逃逸。在肿瘤微环境中，高度唾液酸修饰的肿瘤细胞可以通过与不同免疫细胞上的Siglec受体结合而与NK或T细胞结合。同时，一些关键信号通路因子如TNFR1和TGF-β1的异常唾液酸化也可促进肿瘤的进展。此外，唾液中Lewis X抗体和Lewis抗原的合成也促进了肿瘤的侵袭和转移。然而，唾液酸化对肺腺癌细胞肿瘤进展的调节尚不清楚。在我们之前的研究中，我们发现ST3GAL6可以促进膀胱癌的进展。我们因此提出了科学问题:ST3GAL家族是否参与了肺腺癌的肿瘤发展过程。我们首先系统地在Oncomine、TCGA和GEO数据库中调查了ST3GAL家族成员的表达水平与LUAD患者的临床相关性。在六个ST3GAL家族成员中，我们发现在Oncomine、TCGA-LUAD和GSE68465数据集中都显示与正常肺组织相比，LUAD样本中ST3GAL6发生下调。并且，ST3GAL6的下调与LUAD样本的分级、组织学亚型呈显著负相关，预示着临床预后不佳。进而探索ST3GAL6在肺腺癌可能的工作机制，通过蛋白质互作分析发现ST3GAL6和EGFR之间存在关联。通过进一步的细胞实验，结果显示，ST3GAL6的敲降促进了肺腺癌细胞A549和HCC827中EGFR/MAPK信号通路激活，伴随着基质金属蛋白酶2和9的表达水平升高，进而促进肿瘤细胞侵袭。此外，ST3GAL6的反义长链非编码RNA ST3GAL6-AS1在mRNA水平上正向调节ST3GAL6，并与ST3GAL6在预测LUAD患者的预后上表现一致，都显示其在肺腺癌中的低表达与LUAD患者更差的预后相关，推测ST3GAL6-AS1可能对ST3GAL6有调节作用。通过细胞实验验证发现ST3GA6-AS1的下调同样导致A549和HCC827中EGFR/MAPK信号通路激活，并促进瘸细胞的侵袭性，进而证明了ST3GAL6-AS1在肺腺癌细胞中正调控ST3GAL6的表达。基于上述结果，我们认为，ST3GAL6-AS1调节的唾液酸转移酶ST3GAL6在LUAD患者中常常表现出表达下调，并负调节EGFR/MAPK信号传导促进癌细胞侵袭，可作为LUAD患者有希望的独立预后标志物。收起

关键词 : 肺腺癌唾液酸转移酶生物标志物预后分析

6. ST6GAL1在乳腺癌中的表达及其预后价值研究

[学位论文] 黄亮复旦大学 2013年博士导师: 邵志敏共69页

摘要 : 目的: 唾液酸转移酶通过异常唾液酸化与肿瘤黏附、迁移、侵袭等多种生物学功能密切相关。本研究通过检测α2，6-唾液酸转移酶(ST6GAL1)在乳腺癌肿瘤组织中的表达，分析其和E-Cadherin表达的相关性，探讨ST6GAL1的预后价值。方法: 利用... 展开

关键词 : 乳腺癌 &alpha 2 6-唾液酸转移酶 E-Cadherin 预后机制

7. ST6Gal-I在肺癌恶性表型和化疗药物敏感性中的作用及分子机制研究

[学位论文] 袁庆民大连医科大学 2018年硕士导师: 汪淑晶共65页

摘要 : 癌症是当今社会第二大致死性疾病，严重威胁着人们的生命和健康。据最新的报道表明，肺癌在男性和女性的发病率都占癌症的第二位，而死亡率更是高居第一。根据肺癌的组织学类型分类，肺癌可以分为：小细胞肺癌和非小细胞肺癌。其中，手术切除是目前非... 展开癌症是当今社会第二大致死性疾病，严重威胁着人们的生命和健康。据最新的报道表明，肺癌在男性和女性的发病率都占癌症的第二位，而死亡率更是高居第一。根据肺癌的组织学类型分类，肺癌可以分为：小细胞肺癌和非小细胞肺癌。其中，手术切除是目前非小细胞肺癌的主要治疗手段，但即使被完整切除，患者仍有很大的几率出现非小细胞肺癌新发肿瘤，因此从分子水平深入研究肺癌发生发展的分子机理，寻找合适的早期诊断和治疗靶点，也是目前研究的攻关重点。唾液酸(sialic acid，SA)属于一种带负电荷的九碳单糖家族，广泛分布于真核生物细胞糖复合物的最外层，它又可以分为两种亚型结构即Nec5Ac和Nec5Gc。根据唾液酸的连接方式可将唾液酸分为α2，3-SA、α2，6-SA及α2，8-SA三大类，唾液酸由唾液酸转移酶催化合成，唾液酸转移酶根据唾液酸的连接方式可以分为四个家族，即ST6Gal家族(α2-6连接)、ST3Gal家族(α2-3连接)、ST6GalNAc家族(α2-6连接)和ST8Sia家族(α2-8连接)。其中，ST6Gal-Ⅰ能够催化唾液酸通过α2，6-连接方式转移到糖链末端的半乳糖残基上。据已有的研究表明，人体大部分组织都表达ST6Gal-Ⅰ，然而，组织之间的表达水平差异很大，并且在许多肿瘤的发生发展过程中常伴随着ST6Gal-Ⅰ表达水平的改变。如，Jung YR et al指出，下调ST6Gal-Ⅰ的表达能够通过抑制KAI1活性提高直肠癌细胞的转移能力，本实验室前期研究表明，ST6Gal-Ⅰ能够促进肝癌细胞和前列腺癌细胞的肿瘤进展，可以作为肝癌细胞和前列腺癌细胞的预后靶标。然而，ST6Gal-Ⅰ在肺癌中的作用及机制研究尚少。因此，本课题主要研究ST6Gal-Ⅰ在肺癌细胞生长、增殖、迁移、侵袭以及化疗药物敏感性中的作用及分子机制。目的：分析ST6Gal-Ⅰ在肺癌组织表达水平及临床意义;研究ST6Gal-Ⅰ表达改变对肺癌细胞生长、迁移和侵袭的影响及机制;探讨ST6Gal-Ⅰ在肺癌对化疗药物敏感性的作用及机制研究。方法：利用免疫组化、Western-blot等方法分析ST6Gal-Ⅰ在肺癌组织表达水平及临床意义;利用Real-time PCR和Western-blot等方法检测ST6Gal-Ⅰ在人正常肺细胞(HBE、HLF)和肺癌细胞(A549、H1299)中的表达差异;使用ST6Gal-Ⅰ-shRNA转染肺癌细胞下调ST6Gal-Ⅰ在肺癌细胞A549与H1299中的表达;利用体外实验如CCK8、细胞平板克隆、划痕和Transwell以及体内裸鼠成瘤实验等来分析ST6Gal-Ⅰ下调对肺癌细胞恶性表型的影响，并用Western-blot分析其分子机制;利用CCK8、流式、DAPI和Western-blot等方法分析下调ST6Gal-Ⅰ对肺癌细胞药物敏感性的影响及其分子机制。结果：ST6Gal-Ⅰ在肺癌组织中的表达明显高于正常肺组织;ST6Gal-Ⅰ在肺癌细胞(A549、H1299)中的表达明显高于正常肺细胞(HBE、HLF);下调ST6Gal-Ⅰ的肺癌细胞株A549和H1299，其增殖、迁移及侵袭能力明显降低;肺癌细胞株A549和H1299ST6Gal-Ⅰ表达下调引起Notch1/MMPs信号通路蛋白表达的明显降低;体内实验结果显示，下调ST6Gal-Ⅰ肺癌细胞株A549其在小鼠体内生长的肿瘤体积和质量都较小，并且其Notch1/MMPs信号通路蛋白的表达也明显低于对照组;下调ST6Gal-Ⅰ肺癌细胞系A549和H1299的药物敏感性明显增强并伴随着凋亡通路蛋白P-Rafl、P-JNK、P-c-Jun和cleaved-caspase-3表达的升高。结论：ST6Gal-Ⅰ在肺癌的发生发展中起到促癌作用;ST6Gal-Ⅰ可通过Notchl/MMPs信号通路调节肺癌细胞的生长、迁移和侵袭;下调ST6Gal-Ⅰ表达可能通过JNK/caspase信号通路促进培美曲赛对肺癌细胞的敏感性，该研究可能为肺癌的临床诊断和治疗带来新的靶点。收起

关键词 : 肺癌唾液酸转移酶促癌作用化疗药物敏感性

8. Siat7A通过激活内质网应激促进心肌肥厚

[学位论文] 边天天大连医科大学 2022年硕士导师: 张冬梅共59页

摘要 : 研究背景：心肌肥厚是长期高血压引发的心肌代偿反应。长期高血压会使得心脏发生细胞肥大、间质纤维化以及冠状动脉微循环紊乱，导致左室舒张和收缩功能以及冠状动脉血流储备发生障碍。肥大心肌压迫冠状动脉出现供血量不足，产生心肌缺血，恶性循环长... 展开研究背景：心肌肥厚是长期高血压引发的心肌代偿反应。长期高血压会使得心脏发生细胞肥大、间质纤维化以及冠状动脉微循环紊乱，导致左室舒张和收缩功能以及冠状动脉血流储备发生障碍。肥大心肌压迫冠状动脉出现供血量不足，产生心肌缺血，恶性循环长期持续最终导致心力衰竭。唾液酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰。研究表明，心肌肥大发生后，唾液酸化水平显著增加。不同基因背景的高血压大鼠肥厚心肌组织中检测了一万六千个基因，仅编码唾液酸转移酶7A（Sialyltransferase7A，Siat7A）的基因持续过表达。内质网是负责蛋白质加工、修饰的重要场所。由于各种病理现象，如DNA损伤、糖基化改变、炎症等会导致未/错误折叠蛋白堆积，从而导致内质网应激。在心血管疾病如心肌肥厚、缺血性心肌病以及心力衰竭的发生发展中内质网应激起着重要的作用。本课题组已经证实在高血压心肌肥厚发生中，Siat7A表达增加，通过激活HIF-1α-TAK1通路促进心肌肥厚。那么在高血压心肌肥厚中Siat7A与内质网应激的发生是否有联系？通过高水平血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）作用制备高血压心肌肥厚模型，探讨高血压心肌肥厚发生是否启动内质网应激，Siat7A在其中是否发挥作用？针对这一问题，对内质网应激以及Siat7A在高血压心肌肥厚中的相互作用进行了探讨。材料方法：在尸检标本中搜集无任何心脏疾病史和患有高血压心肌肥厚病史患者的心脏组织蜡块，制备石蜡切片；选取本课题组先前制备成功且保存良好的高血压心肌肥厚的Wistar大鼠心脏组织蜡块，制备石蜡切片；通过苏木素-伊红（Hematoxylin–Eosin，HE）染色和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）分别观察心肌组织病理改变以及Siat7A、葡萄糖调节蛋白78（Glucose-regulated protein78，GRP78）基因在正常心肌组织和肥大心肌组织中的表达情况。培养AC16细胞，一种具有人心肌细胞特性的细胞系，给予携带干扰Siat7A基因、过表达Siat7A基因的慢病毒转染AC16细胞，筛选出稳定敲低Siat7A、稳定过表达Siat7A基因的细胞株；用0mM、5mM内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）作用细胞，之后用相同浓度的AngⅡ（1μM）刺激细胞；采用实时荧光定量PCR检测ANP、BNP、β-MHC、Siat7A、GRP78mRNA的表达；运用Western Blot技术检测ANP、Siat7A、GRP78蛋白水平的表达；采用免疫荧光技术检测α-actinin、Sialyl-Tn抗原、GRP78的表达情况。提取本课题组制备成功的高血压心肌肥厚大鼠心脏组织的RNA、蛋白样品，采用实时荧光定量PCR检测ANP、BNP、α-skeletal actin、Siat7A、GRP78mRNA的表达，用Western Blot技术检测ANP、Siat7A、GRP78蛋白表达情况。实验结果：在高血压心肌肥厚患者以及AngⅡ诱导的高血压心肌肥厚大鼠的心肌组织中，Siat7A、GRP78表达均升高；敲低Siat7A后，经AngⅡ灌注的大鼠心肌组织中，Siat7A、GRP78表达减少。用AngⅡ（0μM、1μM）刺激AC16细胞，结果显示：在AC16细胞中，1μM AngⅡ处理24小时后，ANP在mRNA水平和蛋白水平表达增加，BNP、β-MHC在mRNA水平表达增加，α-actinin荧光强度增强，Siat7A、GRP78在mRNA水平和蛋白水平表达增加，Sialyl-Tn、GRP78荧光强度增强。在体外实验中，干扰Siat7A基因后，用AngⅡ作用AC16细胞，Siat7A在mRNA水平、蛋白水平表达均降低，Sialyl-Tn荧光强度减弱，ANP在mRNA水平、蛋白水平表达降低，BNP、β-MHC在mRNA水平表达减低，α-actinin荧光强度减弱，GRP78在mRNA、蛋白水平表达降低，GRP78荧光强度减弱；在敲低心肌组织中的Siat7A基因后，用AngⅡ灌注大鼠，Siat7A在mRNA、蛋白水平表达受到抑制，ANP在mRNA、蛋白水平表达减少，BNP、α-skeletal actin在mRNA水平表达降低，GRP78在mRNA、蛋白水平表达降低。AngⅡ刺激特异性过表达Siat7A基因的心肌细胞及大鼠心脏组织，结果显示：Siat7A在mRNA水平和蛋白水平表达增加，Sialyl-Tn荧光强度增强，ANP在mRNA水平和蛋白水平表达增加，BNP、β-MHC在mRNA水平表达增多，α-actinin荧光强度增强，GRP78在mRNA水平和蛋白水平表达增加，GRP78荧光强度增强；α-skeletal actin在mRNA水平表达增多。不同浓度（0mM、1mM、2mM、5mM）的4-PBA作用于AC16细胞2小时后，用1μM AngⅡ处理24小时，随着4-PBA处理的浓度增加，GRP78、ANP在蛋白水平明显减少；5mM4-PBA处理过表达Siat7A的AC16细胞后，用浓度为1μM的AngⅡ处理细胞24小时，过表达Siat7A的AC16细胞经4-PBA处理后，与未经4-PBA处理组相比，ANP、GRP78在蛋白水平表达减少，而Siat7A在蛋白水平表达没有显著性差异。实验结论：1.内质网应激参与高血压心肌肥厚的发生。 2.体内外实验显示Siat7A调控GRP78促进心肌肥厚的发生。收起

关键词 : 心肌肥厚唾液酸转移酶7A 内质网应激病理机制

9. 唾液酸转移酶ST3Gal3在子宫内膜接受态建立中的作用研究

[学位论文] 王浩大连医科大学 2019年硕士导师: 燕秋共53页

摘要 : 目的: 子宫内膜接受态是子宫内膜呈现接受胚胎的能力，受到许多因素调节，例如激素、黏附分子、生长因子和受体等。糖基化是重要的蛋白质翻译后修饰的方式之一，与许多生理过程和疾病密切相关。糖基转移酶(glycosyltransferases)及其催化产物在子... 展开目的: 子宫内膜接受态是子宫内膜呈现接受胚胎的能力，受到许多因素调节，例如激素、黏附分子、生长因子和受体等。糖基化是重要的蛋白质翻译后修饰的方式之一，与许多生理过程和疾病密切相关。糖基转移酶(glycosyltransferases)及其催化产物在子宫内膜接受态的建立过程中呈阶段特异性的表达，影响子宫内膜和胚胎之间的识别黏附。唾液酸转移酶β-galactoside-α2，3-sialyltransferaseⅢ(ST3Gal3)是合成sialyl Lewis X(sLeX)寡糖的关键酶，但是ST3Gal3在子宫内膜接受态建立过程中的表达和功能未见报道。本研究中，通过比较人子宫内膜增生期与分泌期ST3Gal3的表达，发现ST3Gal3与子宫内膜接受态的相关性;利用小鼠妊娠模型，确证ST3Gal3在子宫内膜接受态建立中的作用。本研究通过对ST3Gal3在子宫内膜接受态建立中的作用研究，以期为着床糖生物学提供更深刻的理解。方法: 1.通过Real-time PCR和Western blot方法检测人子宫内膜增生期和分泌期以及HEC-1A（低接受态）和RL95-2（高接受态）细胞中ST3Gal3、ST3Gal4和ST3Gal6的mRNA和蛋白质水平。 2.通过免疫组织化学染色检测人子宫内膜增生期和分泌期ST3Gal3、ST3Gal4和ST3Gal6的表达水平。 3.利用Real-time PCR、Western blot检测ST3Gal3-siRNA的转染效率，通过凝集素印记、蛋白质印记和免疫荧光检测ST3Gal3的生成产物α2，3-唾液酸和sLeX的表达。 4.通过CCK8、EdU检测ST3Gal3对细胞生长的影响。 5.通过扫描电镜以及细胞黏附实验检测下调ST3Gal3以及唾液酸苷酶(Neuraminidase)处理细胞对RL95-2细胞的黏附能力的影响。 6.检测小鼠怀孕从第一天到第五天的ST3Gal3、α2，3-唾液酸和sLeX的表达情况;通过小鼠怀孕第三天子宫角注射ST3Gal3-siRNA和sLeX抗体，第8天收集样品，根据胚胎数量检测胚胎着床效率。结果: 1.增生期和分泌期的子宫内膜组织比较ST3Gal3、ST3Gal4和ST3Gal6的mRNA和蛋白质水平。结果显示ST3Gal3和ST3Gal6在分泌期的子宫内膜组织中高表达，增生期子宫内膜低表达，ST3Gal4没有明显的差异。 2.检测两种人子宫内膜细胞系H EC-1A，RL95-2细胞的ST3Gal3、ST3Gal4和ST3Gal6的mRNA和蛋白质水平。结果显示，RL95-2细胞ST3Gal3的mRNA表达水平是HEC-1A细胞的3.04倍，蛋白质是2.52倍。 3.将scramble siRNA、ST3Gal3siRNA1和ST3Gal3siRNA2瞬时转染至RL95-2细胞。检测ST3Gal3的mRNA和蛋白质水平，结果显示与scramble siRNA比较，转染ST3Gal3siRNA后ST3Gal3表达降低。且转染ST3Gal3siRNA后抑制了α2，3-唾液酸化和sLeX的合成。 4.CCK8、EdU检测结果显示:敲低ST3Gal3后抑制子宫内膜细胞生长和DNA合成。实验检测发现敲低ST3Gal3后抑制了PCNA，Cyclin D1和Cyclin E1，但是增加了P21Cip1的表达。 5.细胞黏附实验结果显示:转染ST3Gal3siRNA后，胚胎细胞与子宫内膜细胞的黏附率显著降低，扫描电镜检测发现敲低ST3Gal3和NEU处理RL95-2细胞后，细胞表面微绒毛的形成减少。 6.收集未孕和怀孕1-5天的小鼠子宫内膜，通过检测发现在小鼠怀孕第4天ST3Gal3、α2，3-唾液酸化和sLeX的表达量最高。 7.小鼠怀孕第三天分别向子宫角注射ST3Gal3siRNA和sLeX抗体，怀孕第八天观察小鼠子宫，结果显示与对照组相比ST3Gal3siRNA或者sLeX抗体注射抑制着床率。结论: 1.ST3Gal3在分泌期人子宫内膜以及高接受态的RL95-2细胞中高表达。 2.下调ST3Gal3抑制RL95-2细胞的增殖和接受能力。 3.小鼠子宫内膜中的ST3Gal3/sLeX寡糖促进胚胎着床。收起

关键词 : 胚胎着床子宫内膜接受态唾液酸转移酶 sLeX寡糖

10. 稳定表达ST3GALⅠ基因的R-MDCK细胞株的建立

[学位论文] 吴亚丽河南农业大学 2015年硕士导师: 李新生;崔保安共51页

摘要 : 细胞膜表面含糖链的唾液酸(Sialic acid，SA)是流感病毒的受体。唾液酸属于九碳糖分子家族，是构成细胞表面糖缀合物的组成成分，通常位于细胞表面糖蛋白、糖脂分子或其他多糖中糖链的最外侧加帽位置，携带负电荷，对于细胞与细胞之间的识别及细胞和细... 展开细胞膜表面含糖链的唾液酸(Sialic acid，SA)是流感病毒的受体。唾液酸属于九碳糖分子家族，是构成细胞表面糖缀合物的组成成分，通常位于细胞表面糖蛋白、糖脂分子或其他多糖中糖链的最外侧加帽位置，携带负电荷，对于细胞与细胞之间的识别及细胞和细胞外基质的相互作用有重要影响。唾液酸是通过其第二位碳原子以α-2，3或α-2，6糖苷键连接于糖链末端的半乳糖基或己糖上，半乳糖Galactoside简称为Gal。这种不同的连接形式是在唾液酸糖基转移酶的催化作用下完成的。介导唾液酸以α-2，6糖苷键连接到半乳糖上的是ST6Gal转移酶，介导唾液酸以α-2，3糖苷键连接到半乳糖上的是ST3Gal转移酶。研究发现，哺乳动物细胞既表达SAα2，3Gal，又表达SAα2，6Gal。禽流感病毒通过其表面的血凝素（HA）与宿主细胞表面的唾液酸寡糖受体相结合侵染宿主细胞，大多数禽流感病毒倾向于识别SAα2，3Gal受体，而人流感病毒则倾向于识别SAα2，6Gal的受体，猪流感病毒则对两者皆有结合能力。但哺乳动物细胞膜上唾液酸α-2，3-半乳糖受体丰度偏低，导致低致病性禽流感病毒在这种细胞中的培养滴度低，严重影响了传代细胞代替鸡胚生产低致病性禽流感病毒疫苗工业的进程。国外学者已将人流感受体组分2，6连接基因ST6GALⅠ整合进MDCK细胞构建成稳定表达细胞系，用以研究人流感病毒对2，6连接性受体的亲和能力。国内的步志高等也构建了适合高致病性禽流感病毒生长的重组MDCK细胞，而低致病性的禽流感病毒的收获滴度却较低，所以筛选能有效提升低致病性禽流感病毒培养滴度的稳定表达鸡ST3GALⅠ基因的MDCK细胞株尤为重要。鉴与此，本研究对鸡ST3GAL转移酶基因进行了优化，方法是克隆鸡ST3GALⅠ基因并将其插入真核表达质粒pIRES中，构建重组质粒pIRES-ST3GALⅠ，通过PCR扩增，限制性酶切和DNA序列分析鉴定目的基因插入大小及方向正确，成功构建了pIRES-ST3GALⅠ真核表达载体。利用真核表达载体pIRES和重组的表达载体分别转化入大肠杆菌DH5α中用不同浓度的IPTG诱导后，发现不同浓度的IPTG诱导的目的蛋白产量之间没有明显的差异，低至0.2~1.2 mmol/L IPTG也可诱导大量目的蛋白产生。SDS-PAGE显示目的蛋白得到了表达。鉴定正确的真核表达载体转染MDCK细胞，用G418抗性筛选稳定表达的重组细胞R-MDCK。PCR及RT-PCR技术鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将不同H9亚型禽流感病毒毒株按相同滴度接种R-MDCK细胞和对照组MDCK细胞，通过HA试验和TCID50试验，检测不同H9亚型禽流感病毒毒株在R-MDCK细胞上的增殖效果。结果4株H9亚型禽流感病毒毒株在R-MDCK细胞HA和TCID50结果均明显高于对照组MDCK细胞。ST3GALⅠ基因在第12代R-MDCK细胞中仍能稳定表达，R-MDCK细胞可有效提升H9亚型低致病性禽流感病毒培养的滴度，可以替代鸡胚用于H9亚型低致病性禽流感病毒的生产。收起

关键词 : 禽流感病毒 3-唾液酸转移酶Ⅰ 基因表达 MDCK细胞