摘要: 背景：环状RNA作为非编码RNA中的重要成员之一，在多种疾病尤其是肿瘤中发挥重要作用。在胰腺癌中，环状RNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。在本研究中发现，高表达的circRHOT1参与胰腺癌细胞的增殖、凋亡、侵袭等恶性生物学行为，尽管环状RNA可... 展开 背景：环状RNA作为非编码RNA中的重要成员之一，在多种疾病尤其是肿瘤中发挥重要作用。在胰腺癌中，环状RNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。在本研究中发现，高表达的circRHOT1参与胰腺癌细胞的增殖、凋亡、侵袭等恶性生物学行为，尽管环状RNA可以通过结合下游的mRNA或靶蛋白发挥作用，以及在特殊位点通过IRES、m6A修饰发挥蛋白翻译功能，但ceRNA机制仍是环状RNA主要作用方式。在进一步查阅文献及网站预测后发现，circRHOT1与miR-125a-3p存在结合位点，提示circRHOT1可能通过ceRNA机制吸附并调控miR-125a-3p的表达水平，而E2F3作为miR-125a-3p的下游关键靶基因，其表达和功能均受miR-125a-3p调控。因此，本研究旨在探索circRHOT1调控胰腺癌细胞恶性生物学行为的主要机制，明确circRHOT1/miR-125a-3p/E2F3信号通路在胰腺癌发生发展中的作用，以期为进一步认识胰腺癌的发病机理和寻找临床诊疗新靶点提供实验理论依据。 第一部分胰腺癌和癌旁组织中circRHOT1、miR-125a-3p和E2F3的表达差异 目的：检测circRHOT1、miR-125a-3p和E2F3在胰腺癌和癌旁组织中的表达水平，分析其表达水平的差异与胰腺癌患者临床特征的相关性。 方法：使用TRIzol法提取28对胰腺癌和癌旁组织中的RNA，通过RT-qPCR分别检测circRHOT1和miR-125a-3p的表达水平。对比癌旁正常组织样本，将circRHOT1的表达水平分为高表达组和低表达组，通过分析其表达水平与患者临床病理的相关性。利用TCGA和GTEx数据库分析E2F3在正常胰腺组织和胰腺癌中的表达差异，并通过生存分析和单因素COX回归分析探讨E2F3与胰腺癌预后的相关性。 结果：（1）通过对比癌旁组织发现，胰腺癌中circRHOT1的表达增高而miR-125a-3p的表达减少（P＜0.01和P＜0.05）；（2）circRHOT1高表达与胰腺癌发生淋巴结转移存在相关性（P＜0.05），而与肿瘤的分期、肿瘤的大小无统计学差异（P＞0.05）。（3）胰腺癌组织E2F3的表达显著高于正常胰腺组织（P＜0.01）。（4）胰腺癌患者的生存时间与E2F3的表达具有相关性（P＜0.05）。 结论：circRHOT1、E2F3在胰腺癌组织中表达升高，而miR-125a-3p在胰腺癌组织中表达降低。circRHOT1在胰腺癌中的高表达与淋巴结转移具有相关性，E2F3的高表达与胰腺癌患者的生存时间相关。 第二部分circRHOT1、miR-125a-3p、E2F3在胰腺癌细胞系中的表达差异及其调控恶性生物学行为的研究 目的：检测circRHOT1、miR-125a-3p和E2F3在胰腺癌细胞系和正常胰腺导管上皮细胞中的表达水平，探索其在调控胰腺癌细胞恶性生物学行为中的作用。 方法：收集四株胰腺癌细胞（SW1990、PANC1、COLO357和CF-PAC1）和正常的胰腺导管上皮细胞（HPDE），通过RT-qPCR检测其circRHOT1、miR-125a-3p和E2F3的表达水平，并用WesternBlot检测E2F3的蛋白表达水平。之后通过慢病毒包裹shRNA用于敲低circRHOT1的表达，并设计miR-125a-3p的mimic和inhibitor用于调控其表达水平；最后利用siRNA敲低E2F3的表达水平。通过CCK8和EdU细胞增殖实验检测细胞的增殖能力，通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期水平，通过平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力，通过Transwell小室实验检测细胞的侵袭能力。 结果：（1）与正常的胰腺导管上皮细胞相比，胰腺癌细胞中circRHOT1和E2F3的表达水平升高（P＜0.01），而miR-125a-3p的表达水平降低（P＜0.01）；（2）敲低circRHOT1的表达后，PANC1细胞的增殖能力、克隆形成能力以及侵袭能力得到了抑制，且促进了细胞凋亡水平，并减少细胞在S期分布比例（P＜0.05）；（3）上调miR-125a-3p的表达后，PANC1细胞的增殖能力、克隆形成能力以及侵袭能力均得到了抑制，且促进了细胞凋亡水平，并减少细胞在S期分布比例（P＜0.05）；而抑制miR-125a-3p的表达后，PANC1细胞的增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力得到了增强，并导致细胞在S期集聚（P＜0.05）；（4）敲低E2F3后，PANC1细胞的增殖能力、克隆形成能力以及侵袭能力得到了抑制，且促进了细胞凋亡水平，并减少细胞在S期分布比例（P＜0.05）。 结论：（1）circRHOT1、E2F3在胰腺癌细胞中表达水平升高，而miR-125a-3p的表达水平降低；（2）circRHOT1、miR-125a-3p和E2F3的表达水平参与调控PANC1细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力，以及影响细胞的凋亡和细胞周期。 第三部分circRHOT1/miR-125a-3p/E2F3调控胰腺癌恶性表型的机理研究 目的：circRHOT1、miR-125a-3p和E2F3三者间关系的验证。 方法：分别通过慢病毒转染、siRNA以及miRNAmimic和inhibitor干预基因的表达，通过RT-qPCR和WesternBlot检测三者间的表达关系，通过双荧光素酶报告基因和挽救实验探究circRHOT1和miR-125a-3p、miR-125a-3p和E2F3间的相互关系。通过生信分析挖掘E2F3在胰腺癌中潜在的互作基因和作用机制。 结果：（1）敲低circRHOT1的表达水平后，miR-125a-3p的表达水平升高，而E2F3的表达水平降低（P＜0.05）；（2）上调miR-125a-3p的表达水平后，circRHOT1的表达水平下降，且E2F3的表达水平也下降（P＜0.05）；而抑制miR-125a-3p的表达水平后，circRHOT1和E2F3的表达水平均升高（P＜0.05）；（3）当敲低circRHOT1后同时抑制miR-125a-3p的表达，E2F3的表达水平较单独敲低circRHOT1时增高（P＜0.01）；（4）双荧光素酶实验显示，circRHOT1WT+miR-125a-3pmimic共转染组的荧光素酶活性较circRHOT1MUT+miR-125a-3pmimic共转染组降低（P＜0.05）；E2F3WT+miR-125a-3pmimic共转染组的荧光素酶活性较E2F3MUT+miR-125a-3pmimic共转染组降低（P＜0.05）。（5）E2F3与CDK家族、RB家族、DNMT1、OSMR、CCNA2等基因互作，协同参与调控FOXO、p53等信号通路。 结论：（1）circRHOT1可调控下游miR-125a-3p和E2F3的表达水平；（2）circRHOT1与miR-125a-3p存在直接的靶向结合关系并可通过竞争性抑制功能影响相互的表达水平；（3）miR-125a-3p可与E2F3的3’UTR区结合从而影响E2F3的mRNA和蛋白水平的表达；（4）circRHOT1对于E2F3的调控功能是通过miR-125a-3p介导。（5）E2F3在胰腺癌中可通过互作蛋白和共表达基因参与调控细胞周期和FOXO、p53等信号通路。 收起