摘要: 选题依据：酸枣仁为鼠李科植物酸枣ZiziphusjujubaMill.varspinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥成熟种子，具有养心安神，敛汗、生津之功效。其化学成分本底清晰，包括皂苷、黄酮、生物碱和脂肪酸等成分。其中，总黄酮质量分数高达3.94%。现代药理学研究... 展开 选题依据：酸枣仁为鼠李科植物酸枣ZiziphusjujubaMill.varspinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥成熟种子，具有养心安神，敛汗、生津之功效。其化学成分本底清晰，包括皂苷、黄酮、生物碱和脂肪酸等成分。其中，总黄酮质量分数高达3.94%。现代药理学研究表明，酸枣仁总黄酮(ZSSF)具有镇静催眠、抗焦虑、抗抑郁、抗炎和抗惊厥等广泛的药理作用。课题组前期研究表明大鼠口服给予酸枣仁水提物后黄酮类成分的血药浓度低。其他课题组研究表明酸枣仁中主要黄酮类成分斯皮诺素口服生物利用率低，仅为2.2%。ZSSF具有广泛药理活性，然而，ZSSF低生物利用度与广泛有效的药理活性相矛盾。前期开展酸枣仁水提物经正常人肠道菌群孵育后，黄酮苷类成分可代谢转化为相应的苷元。肠道微生物对酸枣仁黄酮类成分的转化降解可能是其口服生物利用度低的原因之一。 肠道菌群是人体肠道内的正常微生物，中药在进入机体之后，与肠道微生物菌群发生接触而被代谢，另外一些经肝脏代谢的产物还会通过胆汁的分泌而进入肠道参与肠道菌群代谢，因此研究肠道菌群对药物代谢与药效发挥过程的影响具有重大意义。 本研究采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS/MS)分析ZSSF经正常人肠道菌液发酵前后化学成分的变化；采用16SrRNA测序技术对菌群组成进行分析；采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对发酵前后短链脂肪酸进行测定。研究结果为ZSSF体内代谢吸收及作用机制的深入研究提供科学依据。 目的： 阐明正常人肠道菌群对ZSSF的代谢转化作用；揭示ZSSF对肠道菌群组成和短链脂肪酸含量的作用。 研究方法： 1.ZSSF的制备、质控及活性评价 采用70%乙醇回流提取，水饱和正丁醇萃取及大孔吸附树脂对ZSSF进行纯化；以斯皮诺素为参照，采用紫外分光光度法测定酸枣仁总黄酮百分含量；建立基于UPLC-QTrapMS/MS法同时定性定量ZSSF中swertisin、viceninII、kaempferol-3-O-rutinoside、spinosin、isovitexin、6''''''-feruloylspinosi和rutin的方法；研究ZSSF对阈剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期，睡眠时间及阈下戊巴比妥钠小鼠睡眠率的作用，评价其催眠活性。 2.肠道菌群对ZSSF体外代谢转化研究 采集三男三女正常人新鲜粪便，用无菌DPBS溶液稀释产生肠道菌群孵育液。将正常人肠道菌群孵育液与ZSSF于体外厌氧培养箱孵育0、2、4、8、12、24、48h，采用UPLC-QTOFMS/MS方法对ZSSF及其肠道菌转化代谢产物进行定性表征；对转化0、2、4、8、12、24和48h的黄酮原型及代谢产物进行含量测定；并总结其代谢途径。 3.ZSSF对正常人肠道菌群组成及短链脂肪酸含量的影响 利用16SrRNA测序技术对转化前后孵育液中的肠道菌群进行高通量测序，分析转化前后正常人肠道菌群alpha多样性、物种组成，并分析其物种差异。采用GC-MS技术对ZSSF体外肠道菌群孵育液中0、2、4、8、12、24和48h的aceticacid、propionicacid、isobutyricacid、butyricacid、isovalericacid、valericacid含量进行测定，分析ZSSF干扰正常人肠道菌群后SCFAs的变化。采用偏最小二乘法(PLS)模型，对不同时间点6个短链脂肪酸绝对含量与7个酸枣仁黄酮成分、3个小酚酸代谢产物的绝对含量进行相关性分析。 研究结果： 1.通过提取纯化，得得率为0.4%的ZSSF。采用紫外分光光度法测定总黄酮百分含量为58%。建立了一种基于MRM-IDA-EPI扫描模式同时测定ZSSF中7个黄酮成分的分析方法，对ZSSF中的swertisin、viceninII、kaempferol-3-O-rutinoside、spinosin、isovitexin、6''''''-feruloylspinosi和rutin进行含量测定，计算其质量分数分别为0.20%、0.97%、1.3%、21.4%、0.19%、7.6%、0.4%。药效学研究表明ZSSF低剂量(0.04 g/kg)能显著延长阈剂量戊巴比妥钠小鼠的睡眠时间，ZSSF高剂量(0.16 g/kg)能增加阈下剂量戊巴比妥钠小鼠入睡率。 2.采用UPLC-QTOFMS/MS对ZSSF进行表征，共鉴别了34个黄酮成分，包括19个以genkwanin为母核结构；8个以apigenin为母核结构；3个以kaempferol为母核结构的黄酮成分以及其它4个黄酮。对正常人肠道菌群与ZSSF进行体外孵育后的代谢产物进行表征，鉴定了3-phenylpropionicacid，p-hydroxyphenylpropionicacid，m-hydroxyphenylpropionicacid三个最终代谢产物。厌氧培养条件下，ZSSF与正常人肠道菌液离体培养结果表明，ZSSF中以genkwanin为母核的6-C糖spinosin，6''''''-feruloylspinosin和8-C糖isospinosin均可被分别水解转化为swertisin和isoswertisin；以apigenin为母核的6-C糖isovitexin、8-C糖vitexin和6-C-8-C双碳糖均可被水解转化为apigenin。以genkwanin及apigenin为母核的6-C糖肠道菌代谢速率均快于它们的8-C糖，且与7-C上取代基为羟基(-OH)或甲氧基(-CH3O)无关。Apigenin和kaempferol均能环裂解生成p-HPPA，并进一步生成3-PPA。三种不同母核类型的化合物经肠道代谢后，主要发生了脱糖基和环裂解反应。肠道菌群代谢是酸枣仁黄酮口服生物利用度低的原因之一。 3.采用16SrRNA高通量测序技术发现ZSSF对肠道菌门、属水平的物种组成无显著影响。物种差异结果显示，ZSSF干扰正常人肠道菌后，Eubacteriaceae显著增加，可能是黄酮糖苷肠道菌群水解成苷元及小酚酸的关键菌。对转化不同时间点的肠道菌群代谢产物SCFAs进行测定，结果表明ZSSF干预正常人肠道菌48h后能够显著提高肠道菌代谢产物aceticacid和总SCFAs的生成(p<0.05)，降低isobutyricacid、valericacid、isovalericacid的生成，而对propionicacid、butyricacid无显著影响。基于PLS模型的短链脂肪酸与酸枣仁黄酮原型及代谢产物的相关性分析显示，aceticacid，propionicacid及totalSCFAs与m-HPPA及3-PPA具有较高的正相关性。 结论：通过以上研究，建立了ZSSF质量评价方法及对ZSSF及其代谢产物表征的方法，阐明了其代谢途径；初步阐明了ZSSF对肠道菌结构及代谢产物的调控作用。以上研究结果为阐明ZSSF体外代谢转化机制提供了科学依据。 收起