摘要: 目的： 藏羚羊和高原鼠兔是青藏高原的特有动物，生活在寒冷、低氧和高海拔地区，携带的微生物多是未知的。本课题旨在系统分析藏羚羊粪便和鼠兔肠内容物的可培养菌群，分离疑似新种，发现新的细菌，并探讨其可能的生物学意义。 方法： 1.在... 展开 目的： 藏羚羊和高原鼠兔是青藏高原的特有动物，生活在寒冷、低氧和高海拔地区，携带的微生物多是未知的。本课题旨在系统分析藏羚羊粪便和鼠兔肠内容物的可培养菌群，分离疑似新种，发现新的细菌，并探讨其可能的生物学意义。 方法： 1.在28℃和37℃两种温度下，普通和5%CO2气体环境下，采用脑心浸液含羊血培养基、TSA培养基、NA培养基等，根据菌落形态的多样性进行可培养菌群的分离培养与纯化。提取细菌分离株的基因组核酸，PCR扩增和Sanger测序获得16SrRNA基因序列。通过GenBank和EzTaxon数据库在线比对获得16SrRNA基因序列与已知菌种的相似性，完成菌株的初步鉴定。 2.对鉴定结果为疑似新种的菌株，采用革兰氏染色、透射电镜、孔雀蓝染色、动力实验等进行细菌基本特征检测，基于16SrRNA和基因组序列进行系统进化树分析，采用糖发酵、酶活性、药敏实验等检测菌株的生理生化特征，采用反相高压液相色谱法、二维薄层色谱法、HITACHIL-8900高速氨基酸分析仪等检测菌株的菌体成分，采用基因注释和基因组杂交完成基因组分析。综合分析菌株表型、基因型和生化特征，确定菌株的分类学位置，并完成新种的命名和模式菌株的保藏工作。对分离的已知菌，进行多样性和医学意义分析。 结果： 1.本课题采用2种相同的培养条件，从鼠兔肠内容物成功鉴定到525株菌，隶属于3个细菌门、6个细菌纲、12个细菌目、20个细菌科、23个属、52个种；从藏羚羊粪便中，成功鉴定到734株菌，隶属于3个细菌门、4个细菌纲、9个细菌目、20个细菌科、28个属、73个种。采用22种培养条件，从青藏高原藏羚羊粪便中成功鉴定1977株菌，分布于4个细菌门、7个细菌纲、15个细菌目、30个细菌科、44个属、123个种。报道从临床患者中分离到的条件致病菌有23个种，包括中华不动杆菌、约翰逊放线菌、圆形芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、摩加夫芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌、脂黄素棒杆菌、海迪茨氏菌、Dietzianatronolimnaea、杜兰肠球菌、粪肠球菌、孟氏肠球菌、鹑鸡肠球菌、玫瑰考克氏菌、骚动厄氏菌、栖稻假单胞菌、科尼葡萄球菌、马胃葡萄球菌、华氏葡萄球菌、人葡萄球菌新霉素败血症亚种。从藏羚羊粪便中分离获得的优势种为柠檬节杆菌、木聚糖芽孢杆菌、屎肠球菌。 2.从藏羚羊粪便中分离鉴定细菌新种7个，分别为菌株449T、194T、2129T、2251T、2183T、2184T、592T。经鉴定：(1)菌株449T为栖霉菌属的新种，命名为朱既明栖霉菌(Mycetocola zhujimingii)，是一种以anteiso-C15:0为主要脂肪酸，以MK-10和MK-11为主要呼吸醌，以二磷脂酰甘油和磷脂酰甘油为主要极性脂，以赖氨酸为诊断性氨基酸，与M.zhadangensis进化关系较近；(2)菌株194T为盐地杆菌属的新种，命名为洪涛盐地杆菌(Salinibacterium hongtaonis)，对NaCl呈高耐受性，以anteiso-C15:0和anteiso-C17:0为主要脂肪酸，以赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸为细胞壁主要氨基酸，以MK-11和MK-10为主要呼吸醌,以二磷脂酰甘油和磷脂酰甘油为主要极性脂，不能发酵D-甘露糖，且萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性阴性；(3)菌株2129T命名为李兰娟放线菌(Actinomyces lilanjuaniae)，以C18:1ω9c和C16:0为主要脂肪酸，以二磷脂酰甘油、糖脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇甘露糖苷和磷酸糖脂为主要极性脂，可以发酵D-己糖醇和D-木糖，但是不能发酵D-甘露糖和D-蜜二糖、酯酶(C4)和脯氨酸芳酰胺酶活性阴性，与A.dentalis和A.slackii进化关系较近；(4)菌株2251T命名为廖万清副球菌(Paracoccus liaowanqingii)，以C18:1ω7c为主要脂肪酸，以泛醌10为主要呼吸醌，以磷脂酰乙醇胺、二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂、糖脂为主要极性脂，以meso-2,6-二氨基庚二酸、丙氨酸和谷氨酸为细胞壁肽聚糖氨基酸，分类学地位与P.gahaiensis进化关系较近；(5)菌株2183T和2184T分别命名为俞东征棒杆菌(Corynebacterium yudongzhengii)和梁国栋棒杆菌(Corynebacterium liangguodongii)，是两个硝酸盐还原反应阴性、α-胰凝乳蛋白酶和过氧化氢酶活性阳性、D-果糖和5-钾酮葡萄糖酸酵解阳性、D-乳糖酵解阴性的菌种，两株菌均以二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇甘露糖苷为主要极性脂，以MK-8(H2)和MK-9(H2)为主要呼吸醌，肽聚糖中含有meso-2,6-二氨基庚二酸。进化关系上，俞东征棒杆菌与C.doosanense和C.tapiri近，梁国栋棒杆菌与C.lipophiloflavum和C.mycetoides近；(6)菌株592T命名为陈薇气微菌(Aeromicrobium chenweiae)，菌株可以发酵L-鼠李糖、D-木糖和D-纤维二糖，但无法还原硝酸盐，主要脂肪酸为C18:1ω9c和C18:010-methyl，主要极性脂为二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇，主要呼吸醌为MK-9(H4)和MK-8(H4)，且细胞壁肽聚糖含有LL-二氨基庚二酸。 3.从高原鼠兔肠内容物中分离鉴定细菌新种2个，分别为MF30-AT和MF47T。经鉴定：(1)菌株MF-30AT命名为巴德年壤霉菌(Agromyces badenianii)，为需氧、革兰氏阳性菌，菌株在28℃、有氧、pH7.0的TSA培养基上生长最佳，不能发酵熊果苷、D-果糖、D-蔗糖、糖原、水杨素和淀粉，β-葡萄糖苷酶活性为阴性；(2 )菌株MF-30AT与陈薇气微菌不属于同一个种，被命名为严杰气微菌(Aeromicrobium yanjiei)，菌株可以发酵L-鼠李糖、D-木糖和D-纤维二糖，但无法还原硝酸盐，主要脂肪酸为C18:1ω9c和C18:010-methyl，主要极性脂为二磷脂酰甘油、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇，主要呼吸醌为MK-9(H4)和MK-8(H4)，且细胞壁肽聚糖含有LL-二氨基庚二酸。 结论： 1.采用2种相同的培养条件，从鼠兔肠内容物成功鉴定到525株菌，隶属于3个细菌门、6个细菌纲、12个细菌目、20个细菌科、23个属、52个种；从藏羚羊粪便中，成功鉴定到734株菌，隶属于3个细菌门、4个细菌纲、9个细菌目、20个细菌科、28个属、73个种。采用22种培养条件，从藏羚羊粪便中成功分离到1977株菌，鉴定为4个门、7个纲、15个目、30个科、44个属和123个种，报道从临床患者样本中分离到的细菌种有23个。 2我们发现和命名了九个细菌新种，分别是朱既明栖霉菌(Mycetocola zhujimingii)、洪涛盐地杆菌(Salinibacterium hongtaonis)、李兰娟放线菌(Actinomyces lilanjuaniae)、廖万清副球菌(Paracoccus liaowanqingii)、巴德年壤霉菌(Agromyces badenianii )、俞东征棒杆菌(Corynebacterium yudongzhengii)、梁国栋棒杆菌(Corynebacterium liangguodongii)、陈薇气微菌(Aeromicrobium chenweiae)和严杰气微菌(Aeromicrobium yanjiei)。已经发表新种5个，正在投稿新种4个。 收起