摘要: 目的: 研究长链非编码RNA(LncRNA)H9、S-腺苷高半胱氮酸水解酶(SAHH)以及DNA甲4转移酶1(DNMT1)在苯并[a]芘(BaP)所致BEAS-2B细胞8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(OGG1)甲基化、DNA氧化损伤及细胞周期阻滞的影响。 方法： 通过siRNA技术构建六种低表达... 展开 目的: 研究长链非编码RNA(LncRNA)H9、S-腺苷高半胱氮酸水解酶(SAHH)以及DNA甲4转移酶1(DNMT1)在苯并[a]芘(BaP)所致BEAS-2B细胞8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(OGG1)甲基化、DNA氧化损伤及细胞周期阻滞的影响。 方法： 通过siRNA技术构建六种低表达Csi-H79,si-SAHH,si-DNMT1,si-H19+si-SAHH,si-H19+si-DNMT1,si-SAHH+si-DNMT1)细胞模型，均设有阴性序列对照组。通过采用Westernblot检测DNMTs蛋A表达水平，通过采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测DNMT1活性及8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含罱，通过采用免疫共沉淀(Co-IP)检测SAHH和DNMT1的相互作用，通过免疫荧光(IF)观察H19、SAHH及DNMT1的分布，通过采用焦磷酸测序法检测0GG1基因甲基化水平，通过采用流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布。 结果： 染毒后，BEAS-2B细胞中DNMT1的表达量升高(P＜O.O5)，在32μmol/LBaP染毒24h时较溶剂对照升咼/58%.DNMT3B的表达量降低(P＜0.05)，在32μmol/LBaP染毒24h时较溶剂对照降低了39.4%，而DNMT3A表达量变化在32μmol/LBaP染毒24h时不显著(P＞0.05)。 染毒后各型低表达(si-H19,skSAHH,si-H19,+skSAHH)细胞DNMT1表达和活性水平，与WT染毒细胞相比，明显降低(P＜O.O5))。转染与染毐有交互效应(P＜O.O5)。调整染毒因素为协变量，si-H19+SAHH细胞DNMT1表达和活性水平的修正均数(表达0.68，活性0.62)较WT细胞的修正均数(表达1.18,活性1.18)明显降低(P＜0.05)。 Co-IP结果发现，染毐后WT细胞和si-NC细胞DNMT1结合SAHH蛋白含量与WT末染毒细胞相比，显著升高了42.6%和40.5%(P＜0.05)。在si-H19细胞染毒后，与正常未染毒细胞相比，DNMT1结合SAHH蛋白含量显著升高了56％(P＜0,05〉。转染与染毒有交互效应(P＜0.05).,调整染毒因素为协变量，si-H29细胞DNMT1结合SAHH蚩白含量的修正均数(1.38)较WT细胞的修IE均数(1.21)明显升高(P＜0.05)。 IF结果发现，BaP染毒后，BEAS-2B细胞中H19、SAHH和DNMT1主要在核周质以及细胞核中存在共定位。染毒后细胞内DNMT1蛋白表达的荧光与WT细胞相比加强，H19和DNMT1以及SAHH和DNMT1在核周质以及细胞核中共定位的荧光强度増强。在si-H19细胞染毒后，与si-H19细胞未染毒相比，SAHH和DNMT1在核周质以及细胞核中共定位的荧光强度增强。 焦磷酸测序结果发现，染毒后各型(WT、si-NC、si-DNMT1,si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1细胞OGG1甲基化水平，与WT未染毒细胞相比，均显著升高(P＜0.05)，其屮si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1细胞染毒前后甲基化水平，与WT未染毒细胞相比，均明显升高(P＜0.05)。与WT染毒细胞相比，si-SAHH+si-DNMT1细细胞染毒后OGG1甲基化水平升高了21.1%(P＜0.05)。转染与染毒有交互效应(P＜0.05)。调整染毒因素为协变量，与WT细胞OGG1甲基化水平的修正均数(1.14)相比，si-DWMT1细胞(1.28)和si-?SAHH+si-DNMT1细胞(1.37〉明显升高(P＜0.05)。 ELISA结果发现，染毒后各型(WT、si-NC、si-DNMT1,^si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1)细胞8-OHdG含量，与WT未染毒细胞相比，均显著升高(P＜0.05),且与WT细胞染毒后相比，si-SAHH+si-ZNMT1细胞染毒后8-OHdG含量升高了19.2%(P＜0.05)，si-H19+si-DNMT1细胞则未见明显差异(P＞0.05)。转染与染毒有交互效应(P＜0.05)。调整染毒因素为协变量，与WT细胞8-OHdG含量的修正均数(1.15)相比，si-DNMT1细胞(1.20〉和si-SAHH+si-DNMT1细胞(1.24)明显升高(P＜0.05)。 FCM结果发现,染毒后各型(WT、si-NC、si-DNMT1,si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1)细胞S期细胞比率，与WT未染毒细胞相比，均分别升高了33.6%、34.0%、34.6%、38.0%和60.2%(P＜0.05)，其中无论是否染毒，si-H19+si-DNMT1和si-SAHH+si-DNMT1细胞S期细胞比率，与WT未染毒细胞相比，均明显升高(P＜0.05)；与WT细胞染毒后相比，染毒后si-SAHH+si-DNMT1细胞明显升高了22.6%(P＜0.05)，而si-H19+si-DNMT1细胞则未见明显差异(P＞0.05)。转染与染毒有交互效应(P＜0.05)。调整染毒因素为协变量，与WT细胞S期细胞比率的修正均数(1.24)相比，si-SAHH+si-DNMT1细胞(1.37)明显升高(P＜0.05)。 结论： 1、BaP染毒后H19与SAHH的结合调控DNMT1，使其表达和活性升高。 2、BaP染毒促进SAHH和DNMT1结合，干扰H19进一步增强两者的相互作用。 3、H19/SAHH/DNMT1参与调控OGG1甲基化、DNA氧化损伤和细胞周期。 收起