摘要: 目的: 探讨长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)H19与S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase，SAHH)相互作用调控8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1，OGG1)甲基化水平在苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene... 展开 目的: 探讨长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)H19与S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteine hydrolase，SAHH)相互作用调控8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1，OGG1)甲基化水平在苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，BaP)致人肺源性细胞(16HBE、BEAS-2B、VA13)DNA氧化损伤过程中的作用，以期为揭示BaP暴露致DNA损伤的表观遗传调控机制提供相应线索。 方法: 通过siRNA技术降低人肺源性细胞中H19及SAHH的表达水平，构建H19低表达、SAHH低表达和H19及SAHH双低表达细胞模型，同时设置转染阴性序列对照组;通过质粒转染技术(载体pCMV-GV141)过表达人肺源性细胞中SAHH的表达水平，构建SAHH过表达细胞模型(wild type (WT)-SAHH、M1-SAHH, M2-SAHH, M3-SAHH)，同时设置转染空质粒对照组。用不同浓度BaP(0、1、2、4、8、16、32μmol/L)染毒24h，以16μmol/LBaP染毒不同时间(0、1、2、4、8、12、24h)，同时均设置二甲基亚砜(Dimathyl sulfoxide，DMSO)溶剂对照组。用实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测H19的表达水平。采用lncRNA荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)结合免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)检测H19的分布及其与SAHH的共定位。使用RNA结合蛋白免疫沉淀技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP)检测H19与SAHH的相互作用。通过免疫印迹试验(Western Blot)和荧光分光光度分析法(Fluorometric)检测SAHH蛋白的表达和活性水平。使用焦磷酸测序法(Pyrosequencing)检测8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(8-oxoguanineDNA glycosylase 1，OGG1)甲基化水平。用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)检测细胞8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG)的含量，分析BaP染毒后细胞DNA氧化损伤的情况。采用流式细胞技术(flow cytometry，FCM)分析细胞周期。 结果: 随着染毒浓度和时间的增加，三种人肺源性细胞H19表达量逐渐升高(P＜0.05)，SAHH蛋白表达水平逐渐降低(P＜0.05);在32μmol/LBaP染毒24h时，H19表达量达到峰值，较溶剂对照组增加了(16HBE78.0%，VA1378.4%，BEAS-2B87.2%)，而SAHH蛋白表达水平降至最低，较溶剂对照组降低了(16HBE37.2%，VA1332.1%， BEAS-2B 31.3%)。 lncRNAFISH结合IF结果显示，H19和SAHH蛋白均在细胞质及细胞核中表达，两者表达量在核周质中较高，与正常未染毒细胞相比，16μmol/LBaP染毒24h后细胞内H19基因表达的荧光加强，而SAHH蛋白表达的荧光明显减弱，两者在细胞质和细胞核中共定位的荧光强度增加。 RIP结果显示，与正常未染毒细胞相比，染毒后三种人肺源性野生型(WT)细胞SAHH核糖核酸蛋白复合物(ribonucleoproteins，RNPs)中的H19表达量均显著升高了5.53-8.46倍(P＜0.01)，而GAPDH表达量差异均无统计学意义(P＞0.05)。在SAHH过表达细胞未染毒时，WT-SAHH、M1-SAHH、M2-SAHH细胞内SAHH核糖核酸蛋白复合物中的H19表达量均较WT细胞显著增多(P＜0.01)，且在16μmol/LBaP染毒24h后均明显升高(P＜0.05)，而M3-SAHH细胞染毒前后均与WT细胞相似(P＞0.05)。 与WT未染毒细胞相比，染毒后各型SAHH过表达细胞H19表达量明显升高(P＜0.05)，而M3-SAHH细胞H19表达量升高不显著(P＞0.05)，且与WT-SAHH染毒后相比明显降低(P＜0.05)。与WT未染毒细胞相比，染毒后WT和si-NC细胞SAHH表达和活性水平均明显降低(P＜0.05)，而si-H19细胞SAHH表达和活性水平显著升高了(表达18.5%，活性94.9%)。析因分析结果显示，转染与染毒之间存在交互效应(P＜0.05)。协方差分析控制染毒因素后，si-H19细胞SAHH表达和活性水平的修正均数(表达1.11，活性1.88)较WT细胞的修正均数(表达0.85，活性0.87)明显升高(P＜0.05)。 Pyrosequencing结果显示，与WT未染毒细胞相比，染毒后WT、si-NC、si-SAHH和si-H19+si-SAHH细胞OGG1甲基化水平均明显升高(P＜0.05)，而si-H19细胞染毒前后的OGG1甲基化水平均明显降低(P＜0.05)，较WT未染毒细胞分别降低了12.5%和28.2%(P＜0.05)。析因分析结果显示，转染与染毒之间存在交互效应(P＜0.05)。协方差分析控制染毒因素后，与WT细胞OGG1甲基化水平的修正均数(2.2%)相比，si-H19细胞(1.5%)明显降低(P＜0.05)，而si-SAHH细胞(2.5%)升高(P＜0.05)，si-H19+si-SAHH细胞(2.1%)则未见明显差异(P＞0.05)。 ELISA结果显示，与WT未染毒细胞相比，染毒后各型细胞8-OHdG含量均明显升高(P＜0.05)，且与WT细胞染毒后相比，si-H19细胞明显降低了7.6%，而si-SAHH细胞显著升高了20.4%(P＜0.05)，si-H19+si-SAHH细胞则未见明显差异(P＞0.05)。析因分析结果显示，转染与染毒之间存在交互效应(P＜0.05)。协方差分析控制染毒因素后，与WT细胞8-OHdG含量的修正均数(1.13)相比，si-H19细胞(1.09)降低(P＜0.05)，而si-SAHH细胞(1.24)明显升高(P＜0.05)，si-H19+si-SAHH细胞(1.15)则未见明显差异(P＞0.05)。 FCM结果显示，与WT未染毒细胞相比，染毒前si-SAHH和si-H19+si-SAHH细胞S期细胞比率分别升高了31.1%和18.1%(P＜0.05)，染毒后各型细胞S期细胞比率均明显升高(P＜0.05);与WT细胞染毒后相比，染毒后si-H19细胞明显降低了13.6%(P＜0.05)，而si-SAHH细胞明显升高了13.5%(P＜0.05)，si-H19+si-SAHH细胞则未见明显差异(P＞0.05)。析因分析结果显示，转染与染毒之间存在交互效应(P＜0.05)。协方差分析控制染毒因素后，与WT细胞S期细胞比率的修正均数(1.18)相比，si-SAHH和si-H19+si-SAHH细胞(1.40、1.31)明显升高(P＜0.05)，而si-H19细胞(1.17)未见明显差异(P＞0.05)。 结论: 1、BaP暴露促进H19与SAHH相结合并抑制SAHH表达及活性。 2、H19与SAHH的相互作用参与调控OGG1甲基化水平。 3、H19/SAHH调控OGG1甲基化水平在影响BaP致DNA氧化损伤的过程中发挥作用。 收起