摘要: 高半胱氨酸(Hcy)，一种典型的含有巯基的氨基酸。当体内Hcy含量异常升高时会严重损害DNA的修复机制，诱导细胞的凋亡，甚至还会引起阿尔茨海默综合症(Alzheimer's disease，AD)、高半胱氨酸血症、冠心病等。体内Hcy的生成是由S-腺苷高半胱氨酸水解酶(... 展开 高半胱氨酸(Hcy)，一种典型的含有巯基的氨基酸。当体内Hcy含量异常升高时会严重损害DNA的修复机制，诱导细胞的凋亡，甚至还会引起阿尔茨海默综合症(Alzheimer's disease，AD)、高半胱氨酸血症、冠心病等。体内Hcy的生成是由S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-homocysteine hydrolase，SAHH，E.C.3.3.1.1)催化S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocystein，SAH)可逆水解生成腺苷(Ado)和Hcy。细胞中Hcy的生成只有水解SAH这唯一的一条代谢途径，所以体内Hcy含量的高低与SAHH蛋白酶有着密切的关系。本论文旨在通过体外合成具有生物活性的SAHH，并且以该SAHH为研究基础筛选得到可以抑制SAHH活性的抑制剂。此抑制剂有可能为治疗以及防止AD、高半胱氨酸血症、冠心病等老年性疾病提供了新的、更有效的临床治疗方法。 本论文通过基因工程技术将sahh克隆到pPic9k质粒中构建pPIC9K-sahh重组表达质粒。该重组表达质粒在限制性内切酶—BglⅡ的作用下酶切，酶切后目的基因通过电转化的方法整合到毕赤酵母菌(P.pastoris) GS115的基因组。为了得到高抗性的转化子，利用不同梯度浓度的G418遗传霉素进行高抗性筛选，最终筛选得到高拷贝、高抗性的转化子。将筛选到的高拷贝转化子通过菌体的PCR进行扩增，鉴定其为阳性的转化子。将得到的阳性转化子并在1％的甲醇诱导下表达目的蛋白SAHH。随后收集目的蛋白进行镍柱纯化，纯化后的SAHH用5，5-二硫二硝基苯甲酸（DTNB）定量的检测其酶活，其比活（aspec）为0.366 U/mg。为了进一步更好的了解此酶，本论文还进行了酶促反应动力学研究，探究得到该水解酶的Km=21.8μM，VMx=22.9μM/min，最适反应温度为41℃，最适反应的pH为6.5。 本研究充分利用ChemMapper、SciFinder Scholar等信息平台来进行抑制剂的初步筛选。通过DTNB试剂检测其酶活的变化情况来进一步的筛选，从而确定具有抑制效果的SAHH的抑制剂。最终成功筛选得到一种抑制效果相对较高的小分子化合物—4-(3-Hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol（松柏醇），其半抑制浓度(half maximalinhibitory concentration,IC50)为34.04 nM。 收起