摘要: 巴斯德毕赤酵母是一类可以高效表达外源蛋白的单细胞真核微生物，其表达系统被广泛应用于生物制剂和工业酶生产。目前，已有超过5000种外源蛋白在毕赤酵母中成功表达，但是很多外源蛋白分泌表达时产量较低或无法满足工业生产要求。为了解决外源蛋白产... 展开 巴斯德毕赤酵母是一类可以高效表达外源蛋白的单细胞真核微生物，其表达系统被广泛应用于生物制剂和工业酶生产。目前，已有超过5000种外源蛋白在毕赤酵母中成功表达，但是很多外源蛋白分泌表达时产量较低或无法满足工业生产要求。为了解决外源蛋白产量低的问题，增加外源基因表达量以及优化巴斯德毕赤酵母蛋白表达系统成为常用的手段。 相比较于酿酒酵母可达到100％的定向打靶效率，巴斯德毕赤酵母实现靶向基因的敲除比较困难，其同源重组效率通常在0.1％至30％之间。为了解决在巴斯德毕赤酵母中基因敲除困难的问题，本论文在毕赤酵母中成功建立了基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，实现了多个单基因的敲除。我们通过设计并构建打靶质粒，利用双向启动子PHTX1分别稳定表达Cas9和gRNA。其中，在gRNA的5''端和3''端位置分别插入来自核酶的HH和HDV元件。基于此，我们分别对基因GUT1、VPS21、PRB1和MIG2进行了单基因敲除，敲除效率分别达到69％，92％，50％和93％左右。这一技术为在多位点引入外源基因以及通过优化巴斯德毕赤酵母底盘细胞提高外源蛋白表达提供了技术手段。 我们选择以尿胰蛋白酶抑制剂（UTI，urinarytrypsininhibitor）作为目标蛋白开展系统研究。为了在分泌过程中增强UTI分泌能力，我们选择UTI蛋白N端融合人血清白蛋白(HSA，humanserumalbumin)，经密码子优化后合成了上述融合蛋白的编码基因(rh-UTI)。同时，考虑到UTI蛋白结构含有7个二硫键位点，我们在增加rh-UTI拷贝数的同时过表达分子伴侣编码基因PDI。PDI可协助rh-UTI蛋白结构二硫键的形成，缓解内质网“超负荷”状态。基于此，我们通过建立的CRISPR/Cas9基因编辑技术，将含有rh-UTI表达框、抗性基因和PDI编码基因表达框整合于毕赤酵母rDNA多个重复位点，使rh-UTI拷贝数增加，从而实现了rh-UTI蛋白表达量的增加。通过该策略，我们对12株含有不同拷贝数rh-UTI的重组菌株进行发酵。其中，菌株C30含有6个拷贝的rh-UTI，相应蛋白产量达到639.46μg/mL，比含有单拷贝rh-UTI的菌株YSB01提高了4倍。同时，我们发现rh-UTI产量与其基因拷贝数并不完全成线性关系，当rh-UTI拷贝数在5-7个之间时，相应菌株rh-UTI蛋白表达量相对较高。 本论文在增加rh-UTI拷贝数的同时过表达分子伴侣PDI，结果发现在重组菌株C7、C30、C33、C26细胞内观察到目标蛋白在内质网腔内发生明显积累的现象，暗示着过表达分子伴侣PDI对减缓蛋白阻滞的效果并不明显。另外，我们发现rh-UTI拷贝数增加之后，有些菌株出现rh-UTI蛋白产量降低或者不产的现象。我们检测了含有不同rh-UTI拷贝数的重组菌株在发酵培养96小时后rh-UTI转录变化情况，结果发现重组菌株rh-UTI拷贝数与相应转录量不完全成线性关系。其中，含多拷贝目标基因的重组菌株C11和C47几乎检测不到rh-UTI转录量。该结果暗示着rDNA区域可能存在基因沉默现象，对rh-UTI蛋白产量产生一定影响。 收起