摘要: 尽管现在的医疗诊断和管理水平都有显著提高，但全球人民的健康和心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)尤其是高血压和心力衰竭造成的社会经济负担，仍然是一个严重的公共卫生问题。研究发现在心力衰竭动物模型中，肾脏中的Neprilysin(NEP)蛋白含... 展开 尽管现在的医疗诊断和管理水平都有显著提高，但全球人民的健康和心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)尤其是高血压和心力衰竭造成的社会经济负担，仍然是一个严重的公共卫生问题。研究发现在心力衰竭动物模型中，肾脏中的Neprilysin(NEP)蛋白含量增加，活性及表达上调。NEP(EC3.4.24.11)是中性内肽酶，也称脑啡肽酶，是一种位于细胞膜表面的Ⅱ型含锌跨膜金属蛋白酶，主要的生理功能是水解肽链氨基端疏水氨基酸残基。NEP对调节血压的肽类物质，如利钠肽(natriureticpeptide，NP)，缓激肽(Bradykinin，BK)，内皮素等具有降解作用，抑制NEP能增加这些血管活性肽的活性，因此NEP成为治疗心血管疾病的一个重要靶点。 本课题主要目的是通过建立以NEP为靶标的高通量筛选模型，并应用该模型筛选可以作为先导化合物的抑制剂。利用毕赤酵母表达系统，构建重组质粒pPICZα-A-NEP，表达载体通过与酵母菌X-33基因组染色体发生同源重组，将外源基因整合于染色体后实现目的蛋白的表达，表达的蛋白通过Ni2+-NTA亲和层析进行分离纯化，以此得到纯度较高的NEP目的蛋白。应用荧光共振能量转移法(FRET)检测蛋白酶活性，优化反应条件，建立药物筛选体系。 应用建立的药物筛选体系筛选了784种化合物和2000种天然产物分段组分，筛选到2种抑制效果较好的化合物，并测定了这2种化合物的IC50值，其中编号为MDCR02的IC50为101.3μmol/L，编号为MDCR04的IC50为0.494μmol/L;筛选到8种抑制率大于90％的天然产物分段组分，通过进行梯度稀释比较抑制效果，最后得到两种抑制效果相对较好的组分，分别是MDCNCL01000241，MDCNCL01000242, IC50值均在10μg/mL以下。这些先导药物的发现有助于针对NEP开发新药。 收起