摘要: 恶性肿瘤能浸润其它组织并形成瘤块，是引起人类死亡的重大疾病之一。近年来，人们通过对肿瘤浸润与转移机制进行广泛研究，发现基质金属蛋白酶(MMPs)，尤其是明胶酶A和B在肿瘤的侵袭与转移中起着重要作用；病理情况下，MMPs一方面通过降解基底膜和包... 展开 恶性肿瘤能浸润其它组织并形成瘤块，是引起人类死亡的重大疾病之一。近年来，人们通过对肿瘤浸润与转移机制进行广泛研究，发现基质金属蛋白酶(MMPs)，尤其是明胶酶A和B在肿瘤的侵袭与转移中起着重要作用；病理情况下，MMPs一方面通过降解基底膜和包绕肿瘤的基质，突破基质屏障，促进肿瘤侵袭转移，另一方面则通过毛细血管内生、新生血管生成等促进肿瘤生长和扩散。因此以MMPs为靶点，开发研制新型抗肿瘤药物得到了相当的关注，MMPs抑制剂已成为目前开发的热点。 但是目前存在的筛选MMPs抑制剂的方法却很少，一些传统的检测酶活性的方法虽然也可以用来检测抑制剂对酶活性的影响，但是这些传统的方法存在无法避免的缺点，不适合用于大量化合物的筛选，如明胶酶谱法是以天然明胶为底物的分析方法，是检测MMP-2,9最常用的方法，灵敏且特异，但比较繁琐，而且可定量的线性范围窄，不适合用于大量酶抑制剂的筛选。为高通量筛选明胶酶抑制剂，几种被设计的跟天然底物非常相似的合成肽底物也已出现，然而这些底物缺乏特异性，常被用来分析许多不同的MMPs。 同时，组合化学技术的产生为药物研究开辟了新的天地，使药物及先导化合物的合成速度大大提高，然而，组合库中多组分的分析及筛选工作往往耗时较长，不能满足快速筛选的需要，因此，建立一种切实可行的快速筛选方法是非常必要的。 基于这些因素，本文建立了两种新方法，对每种方法进行了方法学研究，并进行了应用，对一些化合物进行了初步筛选。 第一种方法是琥珀酰明胶底物法，在本方法中我们考察了反应时间、琥珀酰底物量、缓冲液及缓冲液的pH、离子强度(Ca2+、Zn2+)、反应温度对明胶酶活性测定的影响，并测定了线性、检测限和精密度；在测定化合物的抑酶活性前，先对明胶酶量、钙离子、各种作用时间在抑制剂测定中的影响进行了考察，在精密度合适的情况下，对三类化合物进行了测定，并对抑酶活性较好的化合物进行简单的构效分析。 第二种方法是明胶酶生物色谱法，在此法中，我们对影响明胶酶键合的因素：时间、pH、硫酸铵浓度等进行了考察，并测定了明胶酶键合的重现性、耐受pH、耐受有机溶剂的量及化合物在不同类型柱上的保留情况；接着对流动相的pH、流速、磷酸盐浓度、不同改性剂及甲醇的不同含量等因素对化合物在明胶酶柱上的保留行为进行了考察，在各种条件确定的情况下，考察了明胶酶柱的稳定性、重现性；通过此法测定各类化合物，比较了各类化合物的保留行为，从而可比较出化合物对明胶酶的抑制情况。 对两种方法测定的结果进行了比较，分析了化合物结构与抑酶活性的关系，发现两种方法的结果基本上能够吻合，由此可见，本文建立的方法能够用于明胶酶抑制剂的筛选。 这两种方法相比于传统的酶谱法、免疫法来说，是比较快速的、简便的，并且用量少，可以节约样品，配上自动加样、自动进样、自动检测等设备可望实现高通量筛选；但是也存在一些不足，需要进一步研究，改善。 收起