摘要: 血管紧张素转化酶(ACE,EC3.4.15.1)是由两个独立的活性结构域(N结构域和C结构域)组成的一种单链蛋白,广泛存在于脊椎动物体内。ACE参与血管紧张素(AngⅡ)的生成和缓激肽(BK)的失活,对保持心血管稳态和血压的稳定起着关键作用。研究证实,ACE-C结构域是... 展开 血管紧张素转化酶(ACE,EC3.4.15.1)是由两个独立的活性结构域(N结构域和C结构域)组成的一种单链蛋白,广泛存在于脊椎动物体内。ACE参与血管紧张素(AngⅡ)的生成和缓激肽(BK)的失活,对保持心血管稳态和血压的稳定起着关键作用。研究证实,ACE-C结构域是使血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)分解为AngⅡ的主要活性位点,而ACE-N结构域则与出血调节有关。因此,以ACE-C结构域作为药物筛选的酶靶,将筛选到更具选择性,更安全的ACEI类药物。 目前,用于ACEI药物筛选的酶靶均属全长ACE,同时含有两个结构域,尚无商品化的ACE-C结构域。本文以毕赤酵母表达的ACE-C结构域为研究目标,旨在建立毕赤酵母高效发酵及纯化工艺,得到高表达,高纯度,高活性的ACE-C结构域蛋白,为设计特异性ACEI类药物提供基础。 实验在摇瓶培养和发酵罐培养水平分别研究了甘油添加量,温度,pH三个因素在生长阶段对菌体密度的影响;以及甲醇添加量,温度,pH三个因素对诱导表达阶段目标蛋白表达量及酶活力的影响;在摇瓶培养参数确定的基础上,在5L发酵罐水平进一步研究种子液转接比例,甲醇流加方式和氮源添加剂对诱导表达阶段目标蛋白表达的影响。针对目标蛋白具His-tag的特征,选择镍柱亲和层析进行分离纯化,采用pH和咪唑浓度梯度洗脱的方法,优化洗脱参数。通过卡托普利(ACEI)对ACE-C结构域和ACE标准品抑制效率的比较,鉴定本研究所得ACE-C结构域是否具有结构域选择性ACEI药物筛选功能。 研究通过发酵及纯化工艺的参数优化,得到以下结果:在摇瓶水平,确定2%甘油添加量,28℃,pH6.0为最佳的生长条件;1.5%甲醇添加量,26℃,pH5.5为最佳的诱导条件。在大规模发酵水平,利用毕赤酵母高密度培养的优势,得到了较高的菌体密度(OD600≥500),研究发现在工业培养基加入2%蛋白胨为氮源添加剂时,ACE-C结构域的降解现象得到了有效控制,采用1:50的种子液接种比例和分批补料的甲醇流加方式后,ACE-C结构域表达量和酶活力分别达到446 mg/L和38.2 U/mL。菌体密度和目标蛋白表达量较摇瓶水平分别提高了10倍和16倍。建立了高效快速的蛋白纯化工艺,获得的ACE-C结构域蛋白纯度≥94%、回收≥50%,生物功能良好,比活力达到85.47 U/mg,是sigma公司ACE标准品比活力的2倍。通过与ACE标准品进行生物活性比较可知所表达的目标蛋白具有ACE-C结构域结构特征,是优秀的筛选高选择性ACEI类药物的靶蛋白。 研究针对ACE-C结构域的特性,通过毕赤酵母高密度发酵及纯化的参数优化,得到了高表达量,高纯度,高活力的人源ACE-C结构域,为大规模制备ACE-C结构域蛋白,筛选专一性更强的ACE-C结构域抑制剂奠定了应用基础。 收起