摘要: 血管紧张素转化酶(angiotensinconvertingenzyme，ACE，EC3.4.15.1)是一种通过肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)，对血压调节、电解质和体液平衡、心血管系统发育和结构重塑起重要作用的锌离子蛋白水解酶，其抑制剂如Captopril、E... 展开 血管紧张素转化酶(angiotensinconvertingenzyme，ACE，EC3.4.15.1)是一种通过肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)，对血压调节、电解质和体液平衡、心血管系统发育和结构重塑起重要作用的锌离子蛋白水解酶，其抑制剂如Captopril、Enalapril、Benazepril、Fosinopril等已成功地作为治疗高血压的一线药物应用于临床。近年来的研究表明，ACE由两个高度同源，但具有不同功能和特性的结构域组成，位于C端的结构域主要与RAS中血管紧张素Ⅱ的生成有关，引起血压升高；位于N端的结构域主要涉及出血调节。新的抑制剂是在这两种结构域之间结构差异的基础上设计开发的，寻找C-结构域特异性抑制剂已成为当今抗高血压药物研究的热点课题。 白菊Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel又称甘菊，是我国传统的栽培药用植物和浙江省八大名药材“浙八味”之一。化学研究表明，白菊内含菊甙、嘌呤、氨基酸、黄酮类成分及多种维生素和微量元素。经现代中医药理学证明，白菊有清热、平肝、明目功能。根据报道，菊花对冠心病和高血压有治疗作用，对在体心脏有明显的扩张冠脉、增加冠脉流量、提高心肌耗氧量的作用，并减慢心率，影响心肌收缩力。由此推测，菊花中的黄酮类化合物有可能参与对血管紧张素转化酶的抑制作用而起到降压效果。 目前，用于ACEI药物筛选的酶靶主要提取自猪肾、兔肺，尚无商品化的C－结构域的ACE。从NCBI搜索到的人源ACE基因3个不同剪接异构体序列用BioEdit中集成的ClustalW进行多重比对，选择了C端保守序列1875bp作为目的片段，PCR扩增血管紧张素转化酶C－结构域基因片段，克隆至分泌表达载体pPIC9K，转化毕赤酵母GS115，阳性克隆再次电转，用G418筛选高拷贝的酵母菌落进行表达条件优化，获得0.5g/L的蛋白表达量，其酶活力测定为7.178U/mL。经Ni2+亲和层析纯化，获得纯度大于99％的目的蛋白。Captopril对酶的抑制试验证明ACE-C结构域可望成为新一代抗高血压药物ACE抑制剂筛选的理想酶靶。 对白菊总黄酮进行了提取工艺的考察并确立了提取分离纯化方法。将乙醇提取物依次经石油醚、正丁醇萃取，浓缩回收溶剂后经聚酰胺层析柱分离纯化，最后得28个流分和3个单体化合物。 考察了用HPLC法测定白菊黄酮类成分抑制血管紧张素转化酶活性的方法，并用HPLC法对白菊黄酮类化合物进行了血管紧张素转化酶的抑制筛选，确定了抑制成分存在的活性部位。 研究首次在毕赤酵母中表达了人源ACE-C结构域，为天然产物活性筛选提供了高表达的优质酶，建立了血管紧张素转化酶C-结构域特异性抑制剂的筛选模式；建立了白菊黄酮类化合物的提取工艺，为进一步获得天然产物单体化合物设立了平台；白菊黄酮类化合物中ACEI的存在活性部位确定，为接下来以ACEC-结构域为靶点，从白菊黄酮类化合物中筛选具有降血压功效的天然化合物或先导化合物奠定了基础。 收起