摘要: miRNA是一类内源性非编码的单链小分子RNA。成熟的miRNA大小在19～23个寡核苷酸（nt）左右，其与靶基因mRNA3’UTR上靶序列碱基配对，在转录后水平抑制蛋白质翻译或降解mRNA，是发挥功能的基础。miRNA对基因表达的调控现象在真核生物中广泛存在，不同的... 展开 miRNA是一类内源性非编码的单链小分子RNA。成熟的miRNA大小在19～23个寡核苷酸（nt）左右，其与靶基因mRNA3’UTR上靶序列碱基配对，在转录后水平抑制蛋白质翻译或降解mRNA，是发挥功能的基础。miRNA对基因表达的调控现象在真核生物中广泛存在，不同的组织器官、不同类型的肿瘤、肿瘤的不同发展阶段都存在不同的miRNA的表达，使miRNA表达谱具有组织细胞特异性。苯并[a]芘（B[a]P）是常见的环境污染物，在生产和生活中有许多的暴露机会，也是吸烟相关肺癌的发展中起关键作用的成因之一。肿瘤是一类细胞周期性疾病，致癌作用被看作是细胞周期内在机制紊乱的结果。细胞周期存在多个检查点（checkpoint）调节各期间的转换及细胞周期进程。在课题组前期工作中，已发现miR-320和miR-494在anti-BPDE转化的人类支气管上皮细胞中表达最高。本实验选择miR-320和miR-494，以B[a]P染毒小鼠原代支气管上皮细胞，首次探索了miR-320和miR-494在B[a]P染毒细胞的细胞周期中的作用。 方法: 1.小鼠原代支气管上皮细胞的培养在无菌条件下处死小鼠，取出支气管，立即置于预冷的Collection培养基中；移入PBS液中去除周围结缔组织及血管并纵向切开。用Dissociation培养基4℃消化24h加入Culture培养基轻柔地上下倒置管子12次，重复操作一次。离心，用Culture培养基重悬细胞。将此细胞悬液接种于60mm的培养皿中，2h后收集未贴壁细胞。将细胞接种于已用胎盘胶原包被的24孔板内，用Culture培养基在正常培养条件下，37℃、5％CO2下培养24h。次日弃去Culture培养基，添加Differentiation培养基，37℃、5％CO2下培养。 2.原代细胞的染毒B[a]P粉末溶于DMSO中，细胞培养液中DMSO的终浓度不超过0.1％。用经多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆微粒体酶系（S9）并加相应的辅助因子（6-磷酸葡萄糖、辅酶Ⅱ）配制成体外代谢活化系统。S9混合液随配随用。原代细胞在无血清培养的第二天，分别用0.01μM，0.10μM和1.00μM并加S9活化的B[a]P无血清培养基染毒细胞，分别作用12h、24h、48h后弃去染毒液，PBS洗涤，继续在正常培养条件下无血清培养。 3.原代细胞的转染转染实验步骤按照Hiperfect转染试剂24孔板转染操作指南进行。miR-320和miR-494抑制物（anti-miR-320，anti-miR-494）在反应体系的终浓度为30nmol/L，转染培养24h后可弃去培养基。用荧光素FAM标记的阴性对照检测抑制物的转染效率可达90％～95％。 4.QRT-PCR检测miR-320和miR-494的表达用Trizol抽提各组样本的总RNA。按下列成分分别组成20IA miR-320、miR-494及18s RNA的定量PCR反应体系：10μl2×Real-time PCR Master Mix，0.16μl miRNA specific primer set（20μM），2μlcDNA template，and0.2μl Taq DNA聚合酶（5U/μl），加d3H2O至20μl。执行如下程序：95℃3min，95℃30s，62℃40s，循环40次。以18sRNA作为内参照，采用△△Ct法对基因表达进行分析。 5.流式细胞仪检测细胞周期的分布将细胞悬液离心，加入缓冲液重悬细胞，参照Cycle TEST Plus DNA reagent试剂盒说明书进行染色。FACSArray流式细胞仪分析细胞DNA含量，并应用Modfit LT3.0软件分析细胞周期。 6.流式细胞仪检测CDK6的表达水平采用间接免疫荧光标记法进行免疫荧光染色。一抗37℃孵育30min，用缓冲液洗涤2次后加二抗37℃避光孵育30min；缓冲液洗涤、重悬细胞。用FACSArray流式细胞仪进行CDK6含量的检测。以荧光指数（fluorescence index，FI）表示CDK6的相对含量。 7.统计学方法实验数据均以均数±标准差表示，采用SPSS15.0统计软件处理，采用独立样本t检验进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.miR-320和miR-494在B[a]P暴露的小鼠原代支气管上皮细胞的表达分别以0.01μM、0.10μM和1.00μM的B[a]P并加S9活化染毒细胞。各剂量组B[a]P分别作用12h，24h及48h后，miR-320和miR-494表达水平均有不同程度的上调。其中，1.00μM组的miR-320和miR-494表达均显示出明显的时间依赖关系。选取1.00μM B[a]P作用24h的条件进行后续的实验。 2.miR-320和miR-494表达水平的有效抑制miR-320和miR-494的抑制物能分别特异有效地抑制miR-320和miR-494的表达。与B[a]P组相比，miR-320的表达水平在anti-miR-320组降低96.7％，差异显著；而在anti-miR-494组却无明显的变化，差异无统计学意义；同样地，miR-494的表达水平在anti-miR-494组明显地下调98％，差异显著；而在anti-miR-320组变化不明显，差异无统计学意义。 3.miR-320和miR-494对染毒细胞细胞周期的影响小鼠原代支气管上皮细胞经过1.00μM B[a]P作用24h后，出现了G1期阻滞的现象。与溶剂对照组的62.70％±1.54％的G1期细胞比例相比，B[a]P组细胞周期的进程被阻滞，84.28％±0.36％的细胞停留在此间期，差异具有统计学意义。在分别转染了miR-320和miR-494的抑制物的anti-miR-320组和anti-miR-494组中，G1期细胞比例分别降低至60.57％±3.41％和57.52％±2.43％，与B[a]P组相比差异均有统计学意义。而在anti-miR-nc组里，G1期细胞比例无明显的改变。 4.miR-320和miR-494对染毒细胞CDK6表达水平的调控细胞经过1.00μMB[a]P染毒处理24h后，与溶剂对照组相比，CDK6的表达值由0.86±0.06降低至0.41±0.03，下降幅度达52.3％，差异显著。而在分别转染了miR-320和miR-494的抑制物作用24h后，anti-miR-320组和anti-miR-494组均出现CDK6表达水平的恢复，与B[a]P组相比，CDK6的表达量分别有2.0±0.3与2.1±0.6倍的升高，差异具有统计学意义。 结论: 1.用冷消化和无血清培养的方法成功培养了小鼠原代支气管上皮细胞。 2.miR-320和miR-494在B[a]P暴露的小鼠原代支气管上皮细胞中表达增高。 3.miR-320和miR-494的高表达促使细胞G1期阻滞。 4.miR-320和miR-494在一定程度上通过对CDK6表达的调控影响B[a]P暴露的细胞的细胞周期。 本项目特色与创新：在国际毒理学研究领域，较早开展了miRNA研究；首次在原代培养细胞中研究miRNA，并发现miR-320和miR-494对细胞周期的调节作用。 收起