摘要: 14-3-3σ是14-3-3蛋白家族中的一员，14-3-3σ直接参与人类肿瘤的发生、发展，在多种人类恶性肿瘤中常有其蛋白或基因表达异常。hASH1基因是human achaete-scute homologue 1的简称，是bHLH（basic helix-loop-helix）基因家族成员之一，bHLH蛋白构成多... 展开 14-3-3σ是14-3-3蛋白家族中的一员，14-3-3σ直接参与人类肿瘤的发生、发展，在多种人类恶性肿瘤中常有其蛋白或基因表达异常。hASH1基因是human achaete-scute homologue 1的简称，是bHLH（basic helix-loop-helix）基因家族成员之一，bHLH蛋白构成多个转录因子家族，这些转录因子参与胚胎的发育和肿瘤的形成。研究表明在肺神经内分泌癌中14-3-3σ表达明显减少。然而hASH1在肺神经内分泌肿瘤高表达，而在非神经内分泌肿瘤不表达或低表达。 14-3-3σ蛋白参与细胞周期G2期检测点，它的缺失会引起的G2期检测点缺陷，使细胞过早进入有丝分裂而导致肿瘤发生。14-3-3σ基因在乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、皮肤癌和肝癌等多种类型肿瘤中因其启动子CpG甲基化而沉默或低表达。研究证实在神经内分泌肿瘤中同样存在14-3-3σ基因启动子高度的超甲基化从而引起其低表达，并且14-3-3σ表达下降对神经内分泌肿瘤形成可能是必需的。研究发现给予甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-Aza）或组蛋白脱乙酰基酶抑制剂便可逆转14-3-3σ的超甲基化。而hASH1是一种组蛋白甲基转移酶，可以使组蛋白去乙酰化和H3组蛋白4，9，20，27，36位赖氨酸甲基化，从而使基因沉默。同时Osada.H等研究发现：用RNAi方法抑制肺癌细胞系中的hASH1表达，可以引起该肿瘤细胞在G2-M期细胞周期停滞和细胞凋亡，从而达到治疗的目的，但是其分子机制不清。本研究旨在探讨在肺神经内分泌肿瘤中是否存在hASH1通过其甲基转移酶的作用使14-3-3σ启动子超甲基化，引起14-3-3σ沉默或低表达，造成G2-M期检测点缺失，细胞发生恶性转化，从而产生肿瘤，以及14-3-3σ表达与肺腺癌临床病理参数关系。 材料与方法： 一、材料 47例新鲜肺腺癌标本（来自中国医科大学附属一院2008.5-2009.7），其中男性患者16例，女性患者31例；年龄34-73岁（平均52.5±10）；淋巴结转移阳性者23例，淋巴结转移阴性者24例；Ⅰ+Ⅱ共19例，Ⅲ+Ⅳ共28例（国际抗癌联盟2003年分期标准）。 五种细胞系：肺巨细胞癌细胞系BE-1；肺大细胞癌细胞系NCI-H460；肺腺癌细胞系LTEP-α-1，A549；肺小细胞癌细胞系NCI-H446。 二、主要试剂和来源 浓缩型羊抗人14-3-3σ蛋白多克隆抗体（SC-7683，Santa Cruz）， 浓缩型兔抗人hAsh1蛋白多克隆抗体（ab-38557，abCam）， Easy RT-PCR Kit（AE401，北京全式金公司）， TRIzol Reagent（15595-026，invitrogen） hAsh1引物，14-3-3σ引物，β-actin 引物 三、方法 （一）RT-PCR 取组织和对数生长期的细胞用TRIzol（invitrogen）提取总RNA，逆转录条件为30℃ 10min，42℃ 40min，99℃ 5min，5℃ 5min。PCR反应条件为：94℃ 5min，94℃30sec，55℃ 30sec，72℃ 40sec，72℃ 10min。取扩增产物5ul，2％琼脂糖凝胶电泳，用Image J软件进行表达强度分析。 （二）Western Blot 取对数生长期的细胞提取总蛋白，超声破碎2下，15000rpm离心15min，取上清约60ul，5％浓缩胶，15％分离胶电泳，电压浓缩胶60V，分离胶100V。40V电压转印约90min。在TBS/0.3％Tween-20/5％小牛血清中封闭2h。14-3-3σ和hASH1均一抗（1:500）4℃孵育过夜，二抗（1:5000）37℃孵育2h。中心实验室发光检测。以上实验相同条件重复3次。 四、统计学分析 采用SPSS13.0统计学分析软件，对14-3-3σ、hASH1的表达与临床病理因素的关系用X2检验；14-3-3σ和hASH1表达关系采用Spearman等级相关分析，其它采用t检验；P（0.05为有统计学意义。 结果： 一、不同肺癌细胞系中14-3-3σ、hASH1的表达情况及两者关系 （一）RT-PCR结果 在五种肺癌细胞系中14-3-3σmRNA有不同程度的表达，其中小细胞癌细胞系446最高，其次是腺癌细胞系LTE和A549（正常肺组织不表达14-3-3σ）。hASH1在具有神经内分泌特征的肺小细胞癌细胞系446和肺大细胞癌细胞系460中高表达。但从mRNA水平来看两者之间似乎缺乏相关性 （二）Western Blot结果 在五种肺癌细胞系中14-3-3σ蛋白有不同程度的表达，其中小细胞癌细胞系446最高，其次是腺癌细胞系LTE和A549（正常肺组织不表达14-3-3σ）。hASH1在具有神经内分泌特征的肺小细胞癌细胞系446和肺大细胞癌细胞系460中高表达。以上结果与RT-PCR结果基本一致。从蛋白水平来看两者之间同样缺乏相关性 二、肺腺癌中14-3-3σ表达高低与肺腺癌的分化、临床病理分期和淋巴结转移相关 通过RT-PCR方法检测了47例肺腺癌切除标本和癌旁组织，结果显示14-3-3σ mRNA在癌组织表达明显高于对应的正常肺组织，进一步结合临床病理参数统计发现14-3-3σ mRNA在低分化的肺腺癌中表达明显高于高分化肺腺癌，即与肺腺癌的分化程度呈负相关。14-3-3σ mRNA高表达患者与低表达患者相比进展更快（P=0.001），更容易发生淋巴结转移相关（P=0.004），而与患者年龄（P=0.496）和性别（P=0.765）无关。这些结果表明14-3-3σ可能参与了肺腺癌的分化、演进及淋巴结转移。 结论： 14-3-3σ可能与肺腺癌的发生、发展、分化程度、临床病理分期和淋巴结转移有关。并且从总体上看在5种肺癌细胞系中14-3-3σ和hASH1两者表达之间缺乏明确的负相关性。 收起