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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: [目的] 4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(4-Methylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanone,NK)能够促进体内血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)合成增加,与血栓素A2受体(Thromboxane A2 recptor, TP)结合后会产生相应的生理病理反应,能够诱导抑癌... 展开 [目的] 4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(4-Methylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanone,NK)能够促进体内血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)合成增加,与血栓素A2受体(Thromboxane A2 recptor, TP)结合后会产生相应的生理病理反应,能够诱导抑癌基因的高甲基化,导致肿瘤的发生。TXAS和TP基因分别是TXA2合成酶和受体基因,是TXA2合成的限速酶和下游功能性基因,TXA2的高表达是否跟NNK诱导TXAS和TP基因甲基化有关?本研究围绕上述问题通过NNK一次造模法,探讨TXAS和TP基因甲基化与其诱导A/J小鼠肺癌发生发展的关系,旨在为治疗和预防由吸烟引起的肺癌提供新的思路。 [方法] 1.NNK诱发性A/J小鼠肺癌动物模型的建立:60只8-10周龄雌性A/J小鼠,随机分为空白和实验两组,一次性腹腔注射0.1mL NNK(20mg/mL)。分别于4、8、12、16、20、24周眼眶取血后拉颈处死取出肺组织样本。观察4、8、12、16、20、24周肺组织表面图,经HE染色后观察肺组织形态学的变化以确认肺癌模型的成功性。 2.TXB2的检测:分别取适量的血清、肺组织,加入TXB2-d4作为内标物,经过离心、乙酸乙酯萃取、HLB固相萃取小柱纯化后氮气吹干,用1mL80%甲醇复溶,0.22μm的滤膜过滤后用LC-MS/MS进行分析,同时用ELISA方法进行分析测试。 3.TXAS和TP基因甲基化的测定:用DNA提取试剂盒提取肺组织的DNA,在NCBI网站上找到TXAS和TP基因序列,利用methprimer软件分别对TXAS和TP基因进行CpG岛分析,根据分析结果用Primer5.0软件对TXAS和TP的CpG岛分别设计引物。 DNA样品经过EZ DNA Methylation-GoldTMKit试剂盒处理后,分别对TXAS和TP基因目的片段进行PCR扩增,所得扩增产物进行琼脂糖凝胶回收纯化,回收纯化的样品经上海生物工程股份有限公司进行克隆测序。 [结果] 1.NNK诱导A/J小鼠肺癌早期动物模型的建立 通过对小鼠的体重、死亡率、肺的表面观、右肺的HE病理切片等方法对NNK诱导的A/J小鼠早期肺癌模型进行评价。比较体重变化和死亡率可知,造模前15周NNK对小鼠机体的毒副作用并不显著,15周后影响较大,体重呈下降趋势。诱导的肺癌模型组中,前16周,各组间并没有明显变化,在16-24周期间,肺泡隔中出现明显的肺组织增生,20、24周肺表面可观察到有肺大疱形成。24周实验组的肺泡间隔增生和肺泡减少异常明显,具有向肺癌发展的迹象。 2.TXB2的LC-MS/MS检测 通过对提取工艺条件进行优化,针对不同的动物组织采取了不同的提取方法,TXB2与组织样品干扰物质达到了较好的分离。TXB2的线性范围为2—100μg·L-1,最低检测限为0.02μg·L-l,最低检出限为0.07μg·L-1相关系数为0.9994。相对标准差为3.2%-7.5%,加样回收率为107.5%-116.4%。 3.造模4周后,实验组小鼠肺组织中TXB2的含量明显高于空白组(P=0.04);4-12周,实验组TXB2的含量与空白组之间没有明显差异(P=0.11),16-24周,实验组TXB2的含量较空白组显著提高(P<0.01)。血清中TXB2的含量在1-12周期间与模型组比较,虽然实验组的含量高于空白组,但并没有明显的差异(P=0.73)。12-24周血清中模型组的TXB2的含量明显高于空白组(P<0.01)。血清中TXB2的含量与ELISA法所测结果一致。 4.对TXAS和TP基因进行CPG岛分析,筛选出CPG岛,分别对各区域进行引物设计及PCR,成功扩增出TXAS基因7682-8031bp区间的CPG岛和TP基因4381-4621bp区间的CPG岛。通过基因的测序结果可知随着NNK造模时间的延长,实验组小鼠TXAS和TP基因的CPG岛的甲基化率逐渐升高,而空白组则没有明显变化。 [结论] 1.通过一次性注射NNK诱导A/J小鼠肺癌早期模型,能很好的模拟由吸烟引起的肺癌发生、发展的过程。 2.建立了改良的TXB2 LC-MS/MS检测方法。使用该方法及ELISA试剂盒对样品中的TXB2进行测定,发现TXA2含量随着NNK造模时间的延长而逐渐升高,与肺部组织癌变呈正相关。 3.分析了TXAS和TP基因甲基化与肿瘤发展之间的相关性,发现随着NNK造模时间的延长,TXAS和TP基因的CPG岛的甲基化率逐渐升高。表明NNK不是通过降低TXAS和TP基因CPG岛的甲基化率而增强TXA2在体内表达和生理功能。 4.NNK诱导A/J小鼠肺癌发生、发展的过程中伴随着TXA2含量升高和TXAS和TP基因甲基率增加。综合评价三者在体内变化可以作为肺癌肿瘤形成、发展的重要指标。 收起
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