摘要: 目的: 化橘红为芸香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’或柚Citrus grandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，前者习称“毛橘红”，后者习称“光橘红”，具有燥湿化痰、理气的功效，主治风寒咳嗽痰多、呕吐呃逆等症，而这些症状均与现代... 展开 目的: 化橘红为芸香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’或柚Citrus grandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，前者习称“毛橘红”，后者习称“光橘红”，具有燥湿化痰、理气的功效，主治风寒咳嗽痰多、呕吐呃逆等症，而这些症状均与现代医学的炎症相关。现代药理研究表明:毛橘红具有抗氧化、抗炎、解热、镇痛的作用，其中的黄酮类成分，含量高达15％以上，极有可能是毛橘红的主要活性成分。野漆树苷作为毛橘红总黄酮的主要组成成分之一，有文献初步研究了其对角叉菜胶诱导的足肿胀模型的抗炎作用，此外未见关于野漆树苷更系统深入的抗炎作用研究，因此基于假设野漆树苷的抗炎作用为其药理效应之一，本文将研究野漆树苷的抗炎作用，并初步探讨其抗炎作用机制，研究将为毛橘红临床应用和资源开发提供一定的实验依据。 方法: 1、野漆树苷对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀模型的影响 将SD大鼠随机分为空白组、黄酮组、野漆树苷高剂量组、野漆树苷低剂量组、地塞米松组，空白组灌胃1％羧甲基纤维素钠，黄酮组给予100mg·kg-1毛橘红总黄酮，野漆树苷高、低剂量组的给药量为40、20mg·kg-1野漆树苷，地塞米松组给予0.8mg·kg-1地塞米松，每天灌胃1次，连续7d。末次给药后，在各组大鼠的右后足趾关节相同位置做标记，并用肢体肿胀测定仪测量大鼠右后足体积，于末次给药1h后，在右后足趾标记位置皮下注入0.1mL角叉菜胶(1％)，于致炎后0、1、2、3、4h测量右后足体积，计算肿胀率，比较各组大鼠足趾肿胀率的差异;末次测量足体积后麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心后测定大鼠血清中炎性介质(TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达水平。 2、野漆树苷对LPS诱使的肺损伤模型的影响 将KM小鼠随机分为空白组、LPS模型组、黄酮组、野漆树苷高剂量组、野漆树苷低剂量组、地塞米松组。空白组给予1％羧甲基纤维素钠，黄酮组给予100mg·kg-1毛橘红总黄酮，野漆树苷高、低剂量组的给药量为40、20mg·kg-1，每天灌胃1次，连续7d。末次给药1h后，模型组与给药组均腹腔注射LPS(20mg·kg-1)造模，空白组腹腔注射生理盐水。给予LPS造模后，在6h内观察小鼠行为学改变并评分。LPS注射6h后，眼球取血，麻醉后取肝脏与肺脏用于观察野漆树苷对LPS诱导的炎症病理损伤影响;小鼠血清用于测定炎性介质(TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达水平。 3、野漆树苷对LPS诱导的炎症性巨噬细胞生长的影响 实验分为空白组、LPS模型组、野漆树苷3.13μmol·L-1、6.25μmol·L-1、12.5μmol·L-1、25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、200μmol·L-1、400μmol·L-1、地塞米松组，采用LPS诱导RAW264.7细胞制备体外炎症模型，MTT法测定野漆树苷对炎症性巨噬细胞生长的影响，Griess法测定RAW264.7细胞上清中一氧化氮的水平，并检测iNOS mRNA表达水平。 4、野漆树苷对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子释放的抑制作用研究 实验分为空白组、LPS模型组、野漆树苷高剂量组(100μmol·L-1)、野漆树苷中剂量组(50μmol·L-1)、野漆树苷低剂量组(25μmol·L-1)、地塞米松组，除空白组之外，其余各组均用LPS刺激6小时，同时加入野漆树苷作用6小时，RT-PCR法检测野漆树苷对LPS诱导的炎症性巨噬细胞TNF-α、IL-6、CCL2mRNA表达水平;实验分为空白组、LPS模型组、野漆树苷高剂量组(100μmol·L-1)、野漆树苷中剂量组(50μmol·L-1)、野漆树苷低剂量组(25μmol·L-1)、地塞米松组，除空白组之外，其余各组均用LPS刺激24小时，同时加入野漆树苷作用24小时，ELISA法测定炎性介质(TNF-α、IL-6、IL-1β)的含量。 5、野漆树苷对LPS诱导的炎症性巨噬细胞MAPK、NF-κB信号通路的影响 实验分为空白组、LPS模型组、野漆树苷高剂量组(100μmol·L-1)、野漆树苷中剂量组(50μmol·L-1)、野漆树苷低剂量组（25μmol·L-1）、地塞米松组，除空白组之外，其余各组均提前用LPS刺激1小时，然后加入野漆树苷作用3小时，采用Western blot法检测炎症相关NF-κB，JNK及Erk MAPK信号通路的表达。 结果: 1、野漆树苷对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀模型的影响 总黄酮组、野漆树苷高剂量组、野漆树苷低剂量组灌胃后对角叉菜胶致大鼠足肿胀模型具有明显的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01);灌胃给予总黄酮以及不同剂量的野漆树苷后，炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)含量较正常组明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。 2、野漆树苷对LPS诱导的肺损伤模型的影响 行为学评分结果显示:与空白组相比，模型组小鼠注射LPS1h后，开始出现竖毛、腹泻、活跃度明显下降、行动迟缓、不思饮食、精神萎靡等，随时间延长，症状更明显，而给药组相比模型组晚1h开始出现上述症状，但腹泻较模型组减轻、活动增加、精神状态有轻微好转。病理检测结果显示总黄酮，野漆树苷灌胃给药后，可显著改善LPS导致的小鼠肝脏、肺脏组织病理损伤;ELISA测定结果显示:与空白组相比，LPS模型组的TNF-α、IL-6、IL-1β的含量显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.001);与LPS模型组相比，总黄酮(100mg·kg-1)、野漆树苷(20、40mg·kg-1)组的促炎介质(TNF-α、IL-1β、IL-6)的产生显著降低，差异有统计学意义。 3、野漆树苷对LPS诱导的炎症性巨噬细胞生长的影响 野漆树苷干预RAW264.7细胞24h后，与正常对照组相比，浓度为3.13-100μmol·L-1的野漆树苷对RAW264.7细胞活性无明显影响，差异无统计学意义(P＞0.05);当野漆树苷浓度为200，400μmol·L-1时，与空白组相比，细胞活率被显著抑制差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）;给予LPS作用后，对炎性巨噬细胞生长无显著影响，差异无统计学意义(P＞0.05)，野漆树苷作用后对巨噬细胞生长与LPS模型组相比也无较大影响，差异无统计学意义（P＞0.05）;野漆树苷作用24h后，与空白对照组相比，LPS(0.5μg·mL-1)刺激的模型组的炎症介质NO水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与LPS模型组相比，野漆树苷高剂量组(100μmol·L-1)、野漆树苷中剂量组(50μmol·L-1)、野漆树苷低剂量组(25μmol·L-1)的炎症介质NO含量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）;单独用LPS刺激RAW264.7cells6h后，与空白组相比，细胞因子iNOS mRNA的表达水平呈现升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）;与LPS模型组相比，野漆树苷高（100μmol·L-1）、中(50μmol·L-1)、低剂量组(25μmol·L-1)，地塞米松组(1μmol·L-1)的iNOS mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。 4、野漆树苷对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子释放的抑制作用研究 单独用LPS刺激RAW264.7cells后，与空白组相比，细胞因子TNF-α、IL-6、CCL2mRNA的表达水平呈现升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）;与LPS模型组相比，野漆树苷高剂量组(100μmol·L-1)细胞的TNF-α、IL-6、CCL2mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），野漆树苷低剂量组(25μmol·L-1)的TNF-α、IL-6mRNA表达水平明显降低，差异有统计学意义;ELISA测定结果显示:单独用LPS刺激RAW264.7cells后，与空白组相比，TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌水平呈现升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）;与LPS模型组相比，野漆树苷高(100μmol·L-1)、中(50μmol·L-1)、低剂量组(25μmol·L-1)的TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平明显降低，并且呈现明显的剂量依赖性，差异有统计学意义(P＜0.05)。 5、野漆树苷对LPS诱导的炎症性巨噬细胞MAPK、NF-κB信号通路的影响等。 结论: 1、野漆树苷对角叉菜胶诱导的足肿胀模型具有明显的保护作用; 2、野漆树苷对LPS诱导的急性肺损伤模型也具有明显的保护作用; 3、野漆树苷对空白RAW264.7巨噬细胞生长的影响较小，不影响LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的生长;野漆树苷可明显抑制LPS诱导炎症巨噬细胞中NO的释放，抑制iNOS mRNA表达水平; 4、野漆树苷可以抑制LPS诱导的炎症介质相关基因(TNF-α、IL-1β、CCL2mRNA)的表达水平，且对LPS诱导的RAW264.7细胞释放得炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)具有明显的抑制作用; 5、野漆树苷可抑制LPS诱导的巨噬细胞内NF-κB、JNK及Erk MAPK信号转导通路的激活。 收起