摘要: 中国大鲵(Andrias davidianus)是我国特有的大型两栖动物，现已成为名贵珍稀水产养殖种类，具有重要的经济价值。然而随着大鲵养殖规模的扩大，养殖数量和密度激增，加之生长环境的恶化，导致大鲵病害频发。因此，研究大鲵病理学和免疫学具有重要的意... 展开 中国大鲵(Andrias davidianus)是我国特有的大型两栖动物，现已成为名贵珍稀水产养殖种类，具有重要的经济价值。然而随着大鲵养殖规模的扩大，养殖数量和密度激增，加之生长环境的恶化，导致大鲵病害频发。因此，研究大鲵病理学和免疫学具有重要的意义。溶菌酶是一种碱性蛋白酶，能够破坏细菌细胞壁肽聚糖中连接 N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖的β酰氨基葡糖苷键，分解粘多糖，使之成为可溶性的糖肽，从而裂解细菌。溶菌酶作为机体的免疫防御因子，能够抵御外来病原菌的感染，在大鲵非特异性免疫过程中起到非常重要的作用。为此，本研究从大鲵转录组数据库中筛选出了c-型和g-型溶菌酶基因片段，鉴定了两种类型溶菌酶基因的cDNA片段，进行了结构特征、表达特性、病原刺激后表达变化分析，以及体外原核表达和产物活性等方面的研究，得到如下结果： （1）AdlysC的cDNA序列长873 bp，其中开放阅读框ORF456 bp，5’-UTR65 bp， 3’-UTR352 bp，编码152个氨基酸，蛋白分子量是16.86 kDa，等电点是8.66；AdlysG的cDNA序列长948 bp，其中开放阅读框558 bp，5’-UTR 270 bp，3’-UTR为120 bp，编码185个氨基酸，蛋白分子量是20.48 kDa，等电点是8.41。 （2）实时荧光定量结果显示，AdlysC在被检测的各个组织中广泛表达，其中在胃和肝脏中的表达量最高，在肠道、脾脏、血液以及肺中的表达较高，在肌肉、肾脏、心脏和脑中表达量较低。AdlysG 表达较为集中，主要在肝脏、脾脏、肺中表达，而在肌肉、肾脏、肠道和皮肤中表达量较低。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）侵染大鲵后，肝脏和脾脏中 AdlysC和AdlysG 的表达水平均显著上调，预示着其在大鲵免疫防御中的重要作用。 （3）构建了pET32a/AdlysC和pET32a/AdlysG重组表达载体，采用大肠杆菌BL21原核表达系统，重组表达rAdlysC和rAdlysG蛋白。通过IPTG诱导表达，Ni2+亲和纯化，包涵体复性等手段，获得了较高纯度的rAdlysC和rAdlysG蛋白。在体外不同pH梯度和温度梯度下，检测了重组蛋白酶的活性，发现rAdlysC和rAdlysG在pH 6.0，30℃下溶菌酶活性最高。通过最小抑菌浓度MIC试验，表明rAdlysC和rAdlysG蛋白对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有一定的抑菌活性，且rAdlysC抗菌活性高于rAdlysG。研究结果不仅对大鲵溶菌酶基因的功能作用和活性特点有了一定的认知，而且为进一步了解大鲵免疫系统中的功能基因奠定了基础。 收起