摘要: 研究目的： 因IFN-τ仅在特定的时间、空间才会表达，并且直接组织培养和提取也很繁琐和复杂。所以，本实验拟采用基因工程技术，将克隆的oIFN-τ(绵羊IFN-τ)τ片段转入大肠杆菌，使oIFN-τ成熟肽在大肠杆菌中得到高效表达，并探索简单有效的roIFN-τ(r... 展开 研究目的： 因IFN-τ仅在特定的时间、空间才会表达，并且直接组织培养和提取也很繁琐和复杂。所以，本实验拟采用基因工程技术，将克隆的oIFN-τ(绵羊IFN-τ)τ片段转入大肠杆菌，使oIFN-τ成熟肽在大肠杆菌中得到高效表达，并探索简单有效的roIFN-τ(recombinantovineinterferon-tau，重组绵羊IFN-τ)纯化、复性方法，获得高纯度高活性的roIFN-τ。为今后大规模生产奠定基础。 研究方法： ■载体构建与目的蛋白的诱导表达 (1)PCR法扩增oIFN-τ完整成熟肽编码基因。 (2)构建oIFN-τ/pBV220/E.coliBL21工程菌。 (3)升温诱导oIFN-τ表达；超声裂解确定目的蛋白的表达方式及最佳表达时间。 (4)蛋白N端测序鉴定目的蛋白。 ■roIFN-τ的发酵表达与纯化复性 (1)上发酵罐，培养工程菌并升温诱导oIFN-τ的表达。 (2)超声裂解菌体获取包涵体，洗液洗涤后以8M尿素变性溶解。 (3)对变性溶解的包涵体蛋白以硫酸铵沉淀法粗纯化，对所获硫酸铵沉淀以包涵体溶解液洗涤的方法进一步去除杂蛋白。 (4)初纯化后的包涵体梯度透析复性。 (5)DEAE-FF阴离子交换柱对复性后蛋白进行再次纯化。 ■重组IFN-τ的活性测定 MTF法测定roIFN-τ比活性。 研究结果： ■载体构建与目的蛋白的诱导表达 (1)对基因的修饰和改造使roIFN-τ成熟肽在大肠杆菌中成功表达，目的蛋白占菌体总蛋白量的约20％。 (2)确定了roIFN-τ以包涵体方式表达，诱导后4h为最佳表达时间。 ■roIFN-τ的发酵表达与纯化复性 (1)裂解菌体，获取包涵体沉淀，并洗涤，Bandscan软件测定目的蛋白占菌体总蛋白量由约20％升至33％。 (2)以45％百分饱和度的硫酸铵沉淀蛋白液，取沉淀，目的蛋白含量升至44.1％，对所获沉淀以包涵体溶解液洗涤的办法重复3次，目的蛋白百分比依次升至58.6％、67.0％和86.3％。 (3)4℃条件下，进行梯度透析，发现很少沉淀形成 (4)对复性后的蛋白进行DEAE-FF柱纯化，纯度又得到大幅提高。得到纯度＞95％的roIFN-τ。 ■重组IFN-τ的活性测定 MTT法测定复性后roIFN-τ的标准效价为2.09×107IU/mL，比活性为2.35×107IU/mg。 结论： 本实验采用基因工程技术使roIFN-τ成熟肽基因在大肠杆菌中得以成功表达。并以硫酸铵沉淀法，包涵体溶解液洗涤法，DEAE-FF阴离子交换柱等纯化方法获得了高纯度的roIFN-τ。经梯度透析复性后，对roIFN-τ进行干扰素效价测定，得到了理想的比活性。 收起