摘要: 次级淋巴组织趋化因子(Secondary Lymphoid-Tissue Chemokine,SLC),即CCL-21,是趋化因子(Chemokine)超家族成员.SLC通过其受体CCR7诱导T淋巴细胞和DC(dendritic cell)进入次级淋巴组织,并由DC提呈抗原,激活T淋巴细胞.因此SLC是引发特异性免疫反应的关... 展开 次级淋巴组织趋化因子(Secondary Lymphoid-Tissue Chemokine,SLC),即CCL-21,是趋化因子(Chemokine)超家族成员.SLC通过其受体CCR7诱导T淋巴细胞和DC(dendritic cell)进入次级淋巴组织,并由DC提呈抗原,激活T淋巴细胞.因此SLC是引发特异性免疫反应的关键趋化因子之一.为此我们克隆了SLC成熟蛋白基因,构建了该基因的原核表达质粒,进行了重组蛋白的诱导表达、纯化及生物学活性的鉴定,旨在为进一步研究SLC在移植排斥反应、肿瘤发展与转移和自身免疫性疾病中的作用机制及应用奠定基础.该项研究取得的主要结果如下:1.通过从人扁桃体中提取总RNA,RT-PCR成功获得编码人SLC成熟蛋白的DNA片段(SLC超始密码子下游第70-405base),并将该片段插入原核表达质粒pET32a(+),成功构建了重组原核表达质粒pET32a(+)/SLC(+3),通过突变去掉目的基因与肠激酶位点间的三个氨基酸,经测序,与GenBank上登录的人SLC成熟蛋白cDNA序列(登录号AB002409)完全一致,获得SLC天然蛋白的重组原核表达质粒pET32a(+)/SLC.2.将该质粒转化大肠杆菌BL21trxB(DE3),经IPTG诱导,获得了高水平表达的融合蛋白(TrxA-SLC),并确定融合蛋白在BL21trxB(DE3)中高效表达的最佳诱导条件为终浓度1mmol/L的IPTG在37℃诱导表达3小时.SDS-PAGE分析可见,表达蛋白的大小约为30kDa,占菌体总蛋白的50%以上,可溶性蛋白约占50%.用羊抗人SLC多克隆抗体进行Western blot分析显示,在30 kDa处出现单一阳性条带,而对照的pET32a(+)/BL21trxB(DE3)诱导菌则无此反应.3.将大量表达的融合蛋白经TALON金属亲和树脂纯化、除盐、肠激酶消化、弱阳离子交换层析,得到电泳纯的SLC重组蛋白.4.生物学活性分析显示,所制备的重组SLC可在体外趋化外周血表达CCR7的淋巴细胞,可引起外周血表达CCR7的淋巴细胞胞内钙流明显升高.功能性重组人SLC的制备,为进一步研究SLC的作用机制及研制其受体CCR7的拮抗剂创造了条件,同时也为相关疾病的治疗性研究奠定了物质基础. 收起