摘要: 北极地区是指北极附近北纬66°34'北极圈以内的地区，常年被海冰大面积覆盖，终年寒冷。特殊的环境增加了北极深海微生物的多样性与特异性。目前，对北极深海微生物研究都是采用传统的纯培养技术，然而，自然环境中99％的微生物都不能在实验室纯培养，... 展开 北极地区是指北极附近北纬66°34'北极圈以内的地区，常年被海冰大面积覆盖，终年寒冷。特殊的环境增加了北极深海微生物的多样性与特异性。目前，对北极深海微生物研究都是采用传统的纯培养技术，然而，自然环境中99％的微生物都不能在实验室纯培养，必然还有大量的不可培养微生物资源有待发现。宏基因组技术绕过纯培养，直接对微生物基因组进行研究，为未培养微生物的研究提供了途径，广泛应用于各种环境下微生物资源的研究。 本论文对2008年7月至9月中国第3次北极科考期间在S24站位(东经205°82.4'，北纬72°40.1')采的深海沉积物提取总DNA，经过Sau3AⅠ酶切后，胶回收1～6kb DNA片段，与经BamHⅠ酶切处理并去磷酸化处理后pUC19质粒连接，转化至DH5α，构建北极S24站位深海沉积物宏基因组文库。每克沉积物样品获得2750个克隆子。随机挑取十个克隆测序，通过ORF Finder tool发现除ccs24-1、ccs24-3外其余克隆子都具有完整的ORF。软件SMART预测ccs24-1可能编码质体醌；ccs24-2可能编码多糖脱乙酰酶；ccs24-3可能编码金属肽酶；ccs24-4可能编码tRNA合成酶和多聚A合成酶；ccs24-5可能编码细菌调节蛋白、乙醛脱氢酶和一个未知功能蛋白；ccs24-6可能编码重金属关联区域；ccs24-7可能编码亚铁螯合酶；ccs24-8可能编码转录调节家族PadA基因和糖基转移酶；ccs24-9可能编码苏氨酸合成酶。虽然该文库库容量有限，但也充分说明北极深海沉积物微生物及其基因的多样性。 ccs24-2克隆子包含的基因具有所有几丁质脱乙酰酶的功能区域，即多糖脱乙酰酶domain，但其N段区域长于其他几丁质脱乙酰酶，而C段区域又稍短，表现出特异性。通过系统发育树分析，该蛋白与α菌纲的Sinorhizobium medicae WSM419及Magnetospirillum magnetotacticum MS-1亲缘关系最近，单独形成一树，也就是说该基因很可能来源与α菌纲的菌株。为了鉴定该基因功能，我们对可能的几丁质脱乙酰酶基因(CDAap-arc)设计引物，与BamHⅠ及HindⅢ酶切处理后pET-28a载体连接，转化至BL21，通过0.5mmol/L IPTG在25℃下诱导表达24h，得到表达产物，分子量约为43kD，将重组菌裂解后的上清作为粗酶液，以对硝基乙酰苯胺为底物测定几丁质脱乙酰酶活性证明该基因的确编码几丁质脱乙酰酶。CDAap-arc最适反应温度为28℃，低于目前已报道的几丁质脱乙酰酶，且热稳定性差，可能由于该基因来源于北极深海这样一个特殊的寒冷环境，最适pH为7.4，耐碱性强于耐酸性。 收起