摘要: 甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hübner），属鳞翅目夜蛾科，是一种世界性分布的害虫。其取食范围非常广泛，对多种粮食作物、蔬菜、经济作物和油料作物等造成严重危害。昆虫几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase，CDA)是几丁质的修饰酶之一，可水解几丁质... 展开 甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hübner），属鳞翅目夜蛾科，是一种世界性分布的害虫。其取食范围非常广泛，对多种粮食作物、蔬菜、经济作物和油料作物等造成严重危害。昆虫几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase，CDA)是几丁质的修饰酶之一，可水解几丁质中的乙酰胺基，将几丁质降解成脱乙酰几丁质，是昆虫几丁质代谢中的一种关键酶，在昆虫的多种生理活动中发挥重要作用。 本研究以甜菜夜蛾S.exigua5龄幼虫中肠为材料提取总RNA，利用RT-PCR及RACE技术，扩增得到甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶1(chitin deacetylase1)基因的cDNA全长序列，GenBank登录号为KJ621414。该基因全长1659bp，包括一个1554bp的开放阅读框，编码518个氨基酸，N-端具有23个氨基酸的信号肽序列，预测蛋白(SeCDA1)分子量为61.5kDa，等电点为4.83; NCBI BLAST分析结果表明，SeCDA1含有低密度脂蛋白结合区(LDLa)、几丁质结合区(ChBD)和脱乙酰基酶催化区(CDA)，属于GroupⅠ类CDA蛋白。氨基酸序列分析发现，该序列分别含有3个N-联糖基化位点和5个O-联糖基化位点。 secda1基因能够在原核细胞中表达61.5kDa目的蛋白，免疫家兔获得SeCDA1蛋白的特异性抗体。secda1基因在毕赤酵母细胞中表达80kDa的目的蛋白。构建重组杆状病毒表达载体pFastBac-secda1，Western blot分析表明secda1基因在昆虫细胞BTI-Tn-5B1-4（HighFive）中成功表达80kDa蛋白。脱乙酰基酶活性测定结果显示昆虫细胞表达的SeCDA1蛋白及毕赤酵母表达的SeCDA1蛋白均具有脱乙酰基酶活性，分别为1.88U/mL及1.35U/mL。 利用SeCDA1特异性抗体对SeCDA1进行免疫组织定位显示，SeCDA1蛋白在卵、幼虫和蛹期中均有表达。qPCR结果显示secda1基因在卵、幼虫和蛹期中均有表达，而在卵中表达量最高，在5龄幼虫头、中肠、马氏管、脂肪体中也有表达，且在体壁中表达水平最高，推测SeCDA1可能参与卵的孵化及幼虫蜕皮过程。 为进一步验证SeCDA1蛋白功能，利用RNA干扰(RNAi)技术将secda1536bp保守序列克隆至pGEM-T载体，成功构建了RNAi重组质粒，大量提取纯化重组质粒，经线性化后合成dsRNA-secda1，为下一步功能研究提供了材料。 收起