摘要: 球孢白僵菌(Beauveriabassiana)作为一种典型的虫生真菌，在农林害虫的生物防治领域具有重要地位。在球孢白僵菌感染宿主的过程中，真菌细胞壁和昆虫角质层通常是真菌与宿主相互作用的第一个位点和屏障，几丁质是真菌细胞壁与昆虫外骨骼的主要成分，能... 展开 球孢白僵菌(Beauveriabassiana)作为一种典型的虫生真菌，在农林害虫的生物防治领域具有重要地位。在球孢白僵菌感染宿主的过程中，真菌细胞壁和昆虫角质层通常是真菌与宿主相互作用的第一个位点和屏障，几丁质是真菌细胞壁与昆虫外骨骼的主要成分，能够为真菌细胞壁和节肢动物的角质层提供必要的刚性和机械强度。几丁质脱乙酰酶(CDA)作为一种重要的几丁质修饰酶，目前已在许多真菌中被发现，但其在昆虫病原真菌中的功能很少报道，本论文以昆虫病原真菌球孢白僵菌为模型，以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的CDA为查询依据，在球孢白僵菌的基因组中搜索出3个含有碳水化合物酯酶4(CE-4)家族保守结构域的CDA成员，通过同源重组的方式构建了ΔCDA1、ΔCDA2和ΔCDA3三个基因敲除突变菌株(CDAs)和它们的基因回补型菌株(CDA1C、CDA2C和CDA3C)。通过对比分析球孢白僵菌野生型菌株(WildType，WT)与不同基因突变菌株之间的表型差异，来探究CDA家族是否参与球孢白僵菌的生长发育和宿主的侵染过程，最终揭示球孢白僵菌CDA发挥的生物学作用。 1.球孢白僵菌CDA家族蛋白进行序列相似性分析表明，CDA1与CDA2和CDA3的序列同源性分别为21.8%和19.7%，CDA2和CDA3的序列同一性为33.8%。通过I-TASSER服务器预测的三级结构结果显示：CDA家族成员都拥有保守的(β/α)8桶状褶皱。 2.通过对分生孢子定量测定发现，三个CDAs基因的缺失导致了不同的结果，ΔCDA1和ΔCDA2的分生孢子产量在第5天到第7天比WT减少25.81%~47.68%，而ΔCDA3分生孢子产量几乎与野生型持平。三个基因敲除突变菌株的芽孢产量在第3天时分别比WT低20.23%、23.21%和27%。此外，ΔCDA1、ΔCDA2和ΔCDA3菌株50%分生孢子萌发所需要的时间(GT50)比WT延长10.16%~12.66%。在分生孢子的高温胁迫试验中，与WT相比，ΔCDA3分生孢子的半致死时间(LT50)降低了15.85%。这些结果表明CDAs的缺失不仅影响球孢白僵菌的孢子数量，还影响孢子的质量。 3.ΔCDA1在SDAY、1/4SDAY、CZA和CZA不含氮源的培养基上，其菌落大小与WT相似。在不含碳源和不含碳氮源的CZA培养基上的菌落大小分别比WT减少了12.54%和10.62%。用N-乙酰氨基葡萄糖替换CZA培养基的碳源后，ΔCDA1表现出与WT相同的生长特征，而ΔCDA1在以几丁质为单一碳源的平板上，其菌落面积比WT减小25%，此外，ΔCDA2和ΔCDA3在上述培养基中与WT均无明显差异。这些结果表明：CDA1可能在识别和利用碳源(特别是几丁质)方面发挥重要作用。 4.CDAs的缺失影响球孢白僵菌的杀虫毒力。使用三龄大蜡蛾幼虫(Galleriamellonella)作为毒力测试的宿主，通过体壁接触感染和血腔注射感染两种方式测定球孢白僵菌对昆虫宿主的侵染毒力。在体壁侵染实验中，ΔCDA1和ΔCDA3的表皮感染幼虫的半致死时间(LT50)分别比WT延长29.33%和23.34%。三个基因敲除突变菌株在昆虫血腔中的感染能力与WT没有明显差异，CDA家族与球孢白僵菌的血腔感染毒力无关，但被三个CDAs基因敲除菌株感染致死后的昆虫表面被更少的菌丝所覆盖。将虫尸继续培养，分析虫尸产孢结果发现被3个基因缺失突变菌株杀死的昆虫，其尸体所新产生的分生孢子量分别比WT低68.45%、63.84%和56.65%，表明CDAs的缺失影响球孢白僵菌的次生产孢能力。 5.CDAs的缺失影响了球孢白僵菌的穿透能力和脱乙酰化作用。在蝉翅穿透实验中，虽然三个基因的缺失突变菌株最终都能成功穿透蝉翅并在培养基上继续生长，但是其菌落大小相对于野生型菌株分别减少了47.76%、29.12%和33.29%，这些结果表明：与WT相比CDAs突变体的穿透能力降低。在酶活力测定实验中，ΔCDA1和ΔCDA3的CDA酶活性分别比WT降低了84.76%和83.04%，而ΔCDA2的酶活性与WT无明显差异，这表明CDA1和CDA3可能在几丁质的脱乙酰化中起着更重要的作用。 综上，CDA蛋白家族的成员在球孢白僵菌的生长、孢子数量与质量、杀虫毒力以及生活史方面发挥着极其重要的作用。本研究的开展为真菌CDA家族蛋白的生物学功能的研究提供了新的理论依据，并为生防真菌提升杀虫效力提供了全新的靶点。 收起