摘要: 目的： (1)在体外诱导骨髓来源的巨噬细胞向M1和M2表型极化并通过流式细胞仪及qPCR方法进行鉴定；然后利用不同极化状态的巨噬细胞与间充质干细胞进行共培养，研究不同极化状态的巨噬细胞在间充质干细胞成骨分化过程中的作用。 (2)探讨M1、M2型... 展开 目的： (1)在体外诱导骨髓来源的巨噬细胞向M1和M2表型极化并通过流式细胞仪及qPCR方法进行鉴定；然后利用不同极化状态的巨噬细胞与间充质干细胞进行共培养，研究不同极化状态的巨噬细胞在间充质干细胞成骨分化过程中的作用。 (2)探讨M1、M2型巨噬细胞中GPNMB的表达差异，然后通过敲除和过表达的方法验证其对间充质干细胞成骨分化的影响并研究其分子机制。 (3)利用小鼠颅骨缺损模型，同时移植巨噬细胞，研究巨噬细胞来源的GPNMB对体内成骨细胞活性的影响，了解巨噬细胞来源的GPNMB对骨缺损修复的影响。 方法： (1)取小鼠骨髓来源的原代单核巨噬细胞并加入20ng/ml rmM-CSF。6天后，分别加入100ng/ml LPS、20ng/ml INF-γ，20ng/ml IL-4刺激24h诱导成M1和M2型。通过流式细胞仪鉴定M1型表面标志物CD86、M2型表面标志物CD206的表达情况；qPCR法检测M1型表面标志物（iNOS,CD86）和M2型表面标志物（Arg-1,CD206）的表达量。 (2)M0型、M1型、M2型巨噬细胞分别与间充质干细胞共培养，同时给予成骨诱导培养基诱导成骨分化。第14天提取RNA检测成骨分化标志物（ALP、Runx2、Collagen I、Osteocalcin）的mRNA表达水平，第21天行茜素红染色。 (3)用qPCR、ELISA方法检测不同极化状态巨噬细胞中GPNMB在mRNA水平和蛋白水平表达差异。通过分离培养过表达和敲除GPNMB的M2型巨噬细胞，与MSC共培养检测其对成骨分化的影响。在MSC成骨诱导过程中加入不同浓度的重组GPNMB蛋白进一步验证其对MSC成骨的影响。给予不同浓度外源性GPNMB蛋白刺激后提取蛋白验证其对MSC中STAT3磷酸化的影响。利用siRNA沉默STAT3后观察GPNMB对MSC成骨分化的影响。 (4)取雄性Gpnmb-/-小鼠，建立颅骨缺损模型，再移植Gpnmb+/+和Gpnmb-/-巨噬细胞。4周后采用?-CT扫描的方法评估不同处理组骨缺损愈合情况，采用组织形态学分析颅骨HE染色切片，评估骨修复过程中骨长入情况。 结果： (1)从小鼠骨髓腔中分离培养的巨噬细胞可以通过LPS/INF-γ成功诱导成M1型，IL-4成功诱导成M2型。M1型巨噬细胞抑制MSC成骨分化，M2型巨噬细胞促进MSC成骨分化。这作用与M2型巨噬细胞高表达GPNMB相关。 (2)过表达Gpnmb基因的巨噬细胞可促进MSC成骨分化，而敲除Gpnmb基因的巨噬细胞可以显著减弱此效应。 (3)外源性GPNMB蛋白可以促进MSC成骨分化。在分子水平上，GPNMB可促进STAT3的磷酸化。siRNA沉默STAT3后可抑制GPNMB促进的MSC成骨分化。 (4)在小鼠颅骨缺损模型中，移植Gpnmb+/+巨噬细胞比移植Gpnmb-/-巨噬细胞缺损修复速度明显加快。 结论： (1)体外分离培养的巨噬细胞在细胞因子诱导下可成功向M1型、M2型极化。 (2)M2型巨噬细胞可促进MSC成骨分化，与M2型巨噬细胞高表达GPNMB相关，抑制M2型巨噬细胞中GPNMB表达后，其促进成骨效应明显减弱。 (3)外源性GPNMB蛋白可通过激活STAT3信号通路促进成骨细胞形成。 (4)在小鼠颅骨缺损模型中，移植Gpnmb+/+的巨噬细胞组的骨愈合能力明显优于移植Gpnmb-/-巨噬细胞组。 收起