摘要: 研究背景： 颅颌面的肿瘤、骨折及骨发育异常等一系列骨缺损相关疾病的治疗是口腔医学领域研究的热点难题。越来越多的研究表明，间充质干细胞(mesenchyme stem cells，MSCs)是骨形成过程中的主要细胞来源，其增殖和成骨分化特性的增强有助于修复骨... 展开 研究背景： 颅颌面的肿瘤、骨折及骨发育异常等一系列骨缺损相关疾病的治疗是口腔医学领域研究的热点难题。越来越多的研究表明，间充质干细胞(mesenchyme stem cells，MSCs)是骨形成过程中的主要细胞来源，其增殖和成骨分化特性的增强有助于修复骨缺损。关键信号通路和关键基因可影响MSCs的增殖及成骨分化功能特性。据报道，骨形成相关的五大信号通路（WNT通路、BMP通路、FGF通路、HH通路、NOTCH通路）与MSCs的增殖及成骨分化功能密切相关。研究表明，Ckip-1（Casein Kinase-2 Interaction Protein-1，酪蛋白激酶2-相互作用蛋白1）是骨形成相关的负调控分子，敲除该基因的小鼠表现为骨量增多，成骨细胞的成骨能力增强。但是，下调Ckip-1能否影响MSCs的增殖及成骨分化特性？以及其在MSCs成骨分化过程中是否可影响骨形成相关信号通路？目前尚未报道。 研究目的： 1.明确Ckip-1对MSCs增殖及成骨分化功能的调控作用； 2.分析下调Ckip-1对MSCs成骨分化过程中对骨形成相关信号通路的调控作用； 3.探讨下调Ckip-1是否可通过WNT信号通路中关键分子Lrp5调控MSCs的增殖及成骨分化功能。 研究方法： 1.利用 RNA干扰、慢病毒转染及药物筛选技术，构建 C3H10T1/2细胞中稳定过表达Ckip-1和低表达Ckip-1的细胞株； 2.利用QPCR与Western Blot实验，检测已构建好的细胞株中Ckip-1基因的转录水平及蛋白表达水平； 3.利用免疫荧光技术，定位Ckip-1蛋白在C3H10T1/2细胞中的位置； 4.利用MTT检测及Annexin V染色方法，比较Ckip-1对C3H10T1/2细胞增殖、凋亡能力的调控作用； 5.利用QPCR技术，比较Ckip-1对C3H10T1/2细胞中成骨相关基因转录水平的调控作用； 6.利用成骨诱导及Alp染色技术，比较Ckip-1对C3H10T1/2细胞成骨能力的影响； 7.利用QPCR技术，分析下调Ckip-1对早期C3H10T1/2细胞中骨形成相关信号通路中关键分子转录水平的影响；及敲除Ckip-1对早期BMMSCs中骨形成相关信号通路中关键分子转录水平的影响； 8.利用QPCR技术，分析下调Ckip-1对C3H10T1/2成骨分化过程中骨形成相关信号通路中关键分子转录水平的影响；及敲除Ckip-1对骨（分化晚期的BMMSCs）中骨形成相关信号通路中关键分子转录水平的影响； 9.利用Western Blot实验，验证下调Ckip-1对C3H10T1/2细胞成骨分化过程中WNT信号通路关键分子Lrp5及β-catenin表达水平的影响； 10.利用MTT检测、Annexin V染色及QPCR技术方法，比较下调Lrp5及下调Lrp5和Ckip-1后对C3H10T1/2细胞增殖、凋亡、成骨相关基因转录水平的影响。 研究结果： 1.荧光显微镜观察发现：各基因转染细胞的效率达到99%以上；细胞生长良好，形态无差异； 2.QPCR与Western Blot实验结果显示：与shCtrl组比较，shCkip-1组中Ckip-1的转录水平及蛋白表达水平都降低，与EV组比较，Ckip-1组中Ckip-1的转录水平及蛋白表达水平都升高； 3.免疫荧光染色结果显示：与shCtrl组比较，shCkip-1组中Ckip-1的蛋白表达水平降低，且其在胞浆胞核都有聚集；与EV组比较，Ckip-1组中Ckip-1蛋白主要聚集在胞膜上，而胞核中无聚集； 4.MTT检测和Annexin V染色结果显示：与shCtrl组比较，shCkip-1组细胞增殖活性增强，凋亡能力减弱；与 EV组比较，Ckip-1组细胞增殖活性减弱，凋亡能力增强； 5. QPCR实验结果显示：与shCtrl组比较，shCkip-1组细胞成骨相关基因（Runx2、Osx、Col1、Ocn、Bsp）转录水平升高；与EV组比较，Ckip-1组细胞成骨相关基因（Runx2、Osx、Col1、Ocn）转录水平降低； 6. Alp染色结果显示：与shCtrl组比较，shCkip-1组细胞Alp活性增强；与EV组比较，Ckip-1组细胞Alp活性减弱； 7. QPCR实验结果显示：与shCtrl组C3H10T1/2细胞比较，shCkip-1组细胞中WNT通路中的Lrp5、Tcf1、Lef1的转录水平升高，BMP通路中的Bmpr1a、Smad4的转录水平升高，FGF通路中的 Fgfr1、Fgfr2的转录水平降低，HH通路中的 Gli2的转录水平升高，而Ptch1的转录水平降低，NOTCH路中的Hes1的转录水平降低，Notch2的转录水平无变化；与WT组BMMSCs比较，Ckip-1-/-组细胞中WNT通路和BMP通路变化与上述结果一致，但FGF通路中的Fgfr1、Fgfr2的转录水平升高，HH通路中的Gli2、Ptch1的转录水平均升高，NOTCH路中的Notch2的转录水平无变化，但Hes1的转录水平降低； 8. QPCR实验结果显示：与shCtrl组成骨诱导的C3H10T1/2细胞比较，shCkip-1组细胞中WNT通路中的Lrp5、Tcf1、Lef1的转录水平升高，BMP通路中的Bmpr1a、Smad4的转录水平升高，FGF通路中的Fgfr1、Fgfr2的转录水平升高，HH通路中的Gli2的转录水平升高，而Ptch1的转录水平降低，NOTCH通路中的Notch2的转录水平不变，但Hes1的转录水平降低；与WT组骨组织比较，Ckip-1-/-组骨组织中WNT通路中的Lrp5、Tcf1的转录水平升高，但Lef1的转录水平降低，BMP通路中的Bmpr1a转录水平不变，但Smad4的转录水平升高，FGF通路中的Fgfr1、Fgfr2的转录水平升高，HH通路中的Gli2的转录水平升高，而Ptch1的转录水平降低，NOTCH通路中的Notch2、Hes1的转录水平降低； 9.Western Blot实验结果显示：C3H10T1/2细胞经成骨诱导7d后，与shCtrl组比较， shCkip-1组中Lrp5的表达水平升高，β-catenin的表达水平变化不大；但在成骨诱导14d后，与shCtrl组比较，shCkip-1组中Lrp5和β-catenin的表达水平均明显升高； 10.MTT检测、Annexin V染色及QPCR实验结果显示：与shCtrl组比较，shLrp5组细胞增殖活性减弱，凋亡能力也有所减弱；与shCtrl组比较，shLrp5+shCkip-1组细胞增殖活性增强，凋亡能力减弱；成骨相关基因转录水平明显升高；与 shLrp5组比较，shLrp5+shCkip-1组细胞增殖活性增强，凋亡能力减弱；成骨相关基因转录水平明显升高。 研究结论： 1.下调Ckip-1可促进MSCs的增殖活性并抑制其凋亡能力，同时促进其成骨分化能力； 2.下调Ckip-1可增强MSCs在成骨分化过程中与骨形成相关的WNT、BMP、FGF、HH信号通路活性，而对NOTCH信号通路有抑制作用； 3.下调Ckip-1可通过WNT信号通路关键分子Lrp5增强MSCs的增殖及成骨分化能力。 收起