摘要: 缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)及氧化应激损伤频繁发生于人体各组织，尤其是在呼吸系统，因为肺和支气管直接与外环境相通并且随时进行着气体交换。大量研究证实H/R通常造成活性氧簇（oxygen species，ROS）生成增加，进而始动不可控的氧化应... 展开 缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)及氧化应激损伤频繁发生于人体各组织，尤其是在呼吸系统，因为肺和支气管直接与外环境相通并且随时进行着气体交换。大量研究证实H/R通常造成活性氧簇（oxygen species，ROS）生成增加，进而始动不可控的氧化应激损伤和随后的细胞凋亡。这些改变伴随着细胞器的失活和多种疾病的发生。另一方面，随着大气污染加剧，环境因素在气道炎症性疾病病理机制中的作用日益受到关注。许多肺部炎症，如慢性阻塞性肺病、支气管哮喘、肺癌、肺气肿等很大程度上以反复发作、病程长为特点。由于通气受限，这些疾病伴随乃至加重了长期、反复的缺氧/复氧损伤和氧化应激状态。因此，以抗气道炎症、抗氧化应激损伤为主的呼吸系统药物研发显得尤为重要。 支气管上皮细胞是呼吸道抵御外界刺激的第一道防线，大气污染物、吸烟、机械性损伤等都可造成支气管上皮细胞损伤。支气管上皮细胞也是遭受H/R损伤的主要部位。氧化应激损伤持续存在，导致支气管、肺组织损伤修复受损，上皮细胞凋亡、脱落，黏液分泌增加，释放多种炎性因子，加重炎症反应。 在本论文的第一部分，利用建立的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮(Nitric Oxide，NO)模型，考察TSG在1.25μM至640μM浓度下对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞生成NO的作用，其IC50=1.20×10-4 M。但对于TNF-α、IL-6和IL-1β的生成影响没有观察到显著性差异。提示TSG具有一定的抗炎活性，但需进一步观察和系统评价，并且根据文献报道，TSG可能具有较好的抗氧化应激损伤活性。故进一步通过建立H/R体外损伤模型，对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)进行了TSG抗缺氧/复氧损伤活性观察。结果显示，H/R处理后，BEAS-2B细胞增殖受到抑制，而TSG的预处理可以显著提高H/R损伤后的BEAS-2B细胞的存活率，并且具有较小的细胞毒性。进一步实验观察到，在12.5μM的浓度下TSG可显著抑制细胞活性氧簇(reactiveoxygen species，ROS)的生成，同时还可以抑制丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的生成，而超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性没有显著性影响。 在本论文的第二部分，对TSG抗氧化应激损伤的机制进行了初步探讨。在前部分结果的基础上，我们进一步通过实验表明，TSG能抑制H/R诱导的支气管上皮细胞BEAS-2B的凋亡。 以GFP-Bax稳定转染的人乳腺癌细胞株MCF-7/GFP-Bax为工具，观察TSG抑制细胞内促凋亡蛋白Bax向线粒体转位和抑制核损伤的活性。Hoechst33258染色结果显示，TSG（50.0μM、100μM）能明显抑制H/R诱导的MCF-7/GFP-Bax细胞核固缩和碎片化等损伤。荧光显微镜下观察到，TSG(25.0μM、50.0μM、100μM)抑制Bax向线粒体的转移定位。在BEAS-2B细胞上通过Western Blot法观察到了同样TSG抑制Bax向线粒体转位的活性。在H/R诱导的BEAS-2B细胞中，TSG可抑制线粒体膜电位下降、细胞色素C释放以及caspase-9、caspase-3活化。 丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)在介导炎症、氧化应激刺激和下游细胞应答中发挥重要调节作用。在H/R发生之时，氧化应激激活MAPK介导细胞存活或凋亡的级联反应。家族内的p38 MAPK和SAPK/JNK1/2由炎性细胞因子和环境应激因素激活，发挥促凋亡作用，ERK1/2则由生长因子及细胞因子激活，发挥促进细胞增殖的作用。通过Western Blot观察了TSG对MAPK信号通路的调节作用。结果显示，TSG可显著降低了p38和JNK1/2在H/R处理的BEAS-2B细胞中的磷酸化蛋白质/总蛋白比，并存在一定的剂量依赖性。另一方面，还观察到了TSG还可以通过降低缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor1，HIF-1)的表达，降低核蛋白p53的磷酸化激活，协同发挥抑制细胞凋亡的作用。 概括来说，本论文分两部分，一部分主要建立了LPS诱导的体外炎症模型和体外H/R损伤模型、观察化合物TSG对小鼠腹腔巨噬细胞抗炎和对支气管上皮细胞抗氧化应激损伤的活性，另一部分主要关注H/R诱导的线粒体凋亡途径、探讨TSG对H/R诱导的支气管上皮细胞氧化应激损伤保护作用的机制，为防治支气管哮喘、慢性阻塞性肺病、肺气肿等呼吸道疾病新型药物研发和缺血-再灌注损伤保护提供了研究思路和实验依据。 收起