摘要: 肝癌是一种高消耗性疾病，患者通过机体组织的分解为肝癌的生长提供能量和底物。因此，肝癌患者大多存在异常代谢旺盛、营养不良等情况，晚期常发展成为恶病质。重组人生长激素（recombinant hunman growth hormone，rhGH）具有代谢调理和免疫调节作用... 展开 肝癌是一种高消耗性疾病，患者通过机体组织的分解为肝癌的生长提供能量和底物。因此，肝癌患者大多存在异常代谢旺盛、营养不良等情况，晚期常发展成为恶病质。重组人生长激素（recombinant hunman growth hormone，rhGH）具有代谢调理和免疫调节作用，可以改变肿瘤患者的异常代谢状态，增强机体抵抗力，从而达到改善肿瘤患者营养状况的目的。但由于rhGH具有促细胞增殖的作用,因此rhGH应用于肿瘤患者的安全性一直受到质疑。使用rhGH是否会促进肿瘤细胞的增殖和转移以及相关信号转导机制如何是临床亟待解决的重要课题。 目的： 本课题以rhGH对高转移潜能人肝癌细胞株MHCC-97H生物学行为的影响为切入点，研究rhGH体外对MHCC-97H肝癌细胞株生长、凋亡及侵袭转移等行为的影响；并通过RNA干扰技术沉默胰岛素样生长因子1受体（insulin like growth factor-1 receptor，IGF1R），研究生长激素／胰岛素样生长因子－1（growth hormone /insulin like growth factor-1，GH/IGF-1）轴被阻断后rhGH对MHCC-97H肝癌细胞株生物学行为影响的变化；探索GH/IGF-1轴后续与肝癌细胞凋亡和侵袭转移相关的信号转导通路；并通过体内实验探索rhGH对裸鼠肝癌成瘤原位肝癌移植瘤生长和侵袭转移能力的影响。研究结果将为阐明rhGH是否能安全应用于肝癌患者临床治疗提供理论依据。 方法： 构建RNA干扰IGF1R真核表达载体，以pGCsi-U6-Neo-GFP为空白质粒载体，以IGF1R为靶基因,按GenBank IGF1R基因核苷酸序列和TuschI设计原则,选择5对2条互补的带发夹结构的核苷酸序列,连接到pGCsi-U6-Neo-GFP空载体中。转染模型细胞（293T），进行RT-PCR及Western-blot检测，筛选出沉默效果最好的RNA干扰IGF1R真核表达载体。再转染MHCC-97H肝癌细胞株，G418筛选并建立IGF1R基因稳定低表达的MHCC-97H肝癌细胞株。用无血清培养液诱导MHCC-97H肝癌细胞株凋亡，采用终浓度为25、50、100、500ug/L的rhGH完全培养液进行干预。观察rhGH对MHCC-97H肝癌细胞株动态生长状况的影响；流式细胞技术检测rhGH对MHCC-97H肝癌细胞株凋亡及细胞周期的影响；通过体外粘附及侵袭实验检测rhGH对MHCC-97H肝癌细胞株体外粘附及侵袭能力的影响；Western-blot法检测磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI-3K)和整合素两条信号通路中关键信号分子丝氨酸-苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）和局部粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）的表达与磷酸化水平的改变。建立裸鼠皮下和原位肝癌移植模型，研究IGF1R基因沉默前后裸鼠皮下移植瘤的成瘤能力，以及IGF1R沉默后rhGH对裸鼠肝癌移植瘤生长和转移的影响。 结果： 构建的RNA干扰IGF1R真核表达载体经酶切和DNA测序证实与设计完全一致。成功筛选出IGF1R基因沉默的MHCC-97H肝癌细胞。经RT-PCR及Western-blot检测后发现IGF1R沉默效率分别为85.9%和80.21%。rhGH干预后IGF1R表达正常的MHCC-97H肝癌细胞生长曲线较对照组明显升高。在浓度为25ug/L、50ug/L、100ug/L的 rhGH干预下IGF1R表达正常的MHCC-97H肝癌细胞S期细胞百分数增加，PI指数升高，细胞凋亡降低，MHCC-97H肝癌细胞粘附于96孔板和穿过transwell小室的细胞数量显著增加(P<0.05)；但rhGH浓度升至500ug/L后MHCC-97H肝癌细胞的生长曲线反而下降，细胞凋亡增加、穿过transwell小室的细胞数量显著减少(P<0.05)。IGF1R基因沉默后MHCC-97H肝癌细胞的生长曲线显著下降、粘附及穿过transwell小室的细胞数量显著减少(P<0.05)；再以rhGH干预后MHCC-97H肝癌细胞的生长曲线无明显抬高、凋亡无显著降低、粘附于96孔板及穿过transwell小室的细胞数量无显著增加（P>0.05）。以Western-blot检测信号分子AKT、FAK的蛋白表达和磷酸化水平发现，rhGH作用后pATK和pFAK磷酸化显著增加(P<0.05)，IGF1R沉默后再加用rhGH，除较高浓度外，其余各组pATK和pFAK表达无明显增加（P>0.05）。体内研究发现rhGH注射可以使荷瘤裸鼠体重明显增加，肝癌移植瘤体积显著增大，（P<0.05）。但MHCC-97H肝癌细胞在裸鼠体内的转移并无显著增加。IGF1R基因沉默后裸鼠皮下移植瘤的成瘤率、原位肝癌接种模型中的肝癌移植瘤的体积显著减小，（P<0.05）。再加用rhGH后其对裸鼠肝癌移植瘤的体积增大无显著促进作用，（P>0.05）。 结论： 浓度为25ug/L、50ug/L、100ug/L的 rhGH在体外可以促进MHCC-97H肝癌细胞株增殖、抑制其凋亡、并对其体外粘附及侵袭能力具有显著促进作用。但rhGH浓度升至500ug/L后MHCC-97H肝癌细胞增殖、侵袭能力反而降低，细胞凋亡增加。RNA干扰IGF1R真核表达载体能够有效沉默MHCC-97H肝癌细胞株IGF1R基因表达。IGF1R基因沉默后rhGH对MHCC-97H肝癌细胞的促进生长、侵袭和转移的作用减弱，抑制凋亡的能力下降。对AKT与FAK的研究表明，rhGH可能通过激活PI-3K和整合素信号转导通路来分别抑制MHCC-97H肝癌细胞株的凋亡和促进其侵袭和转移的作用。体内实验研究表明rhGH具有促进荷瘤裸鼠体重增加及促进移植瘤生长的作用，但对肝癌远处侵袭转移的促进作用不明显，IGF1R沉默后rhGH对移植瘤成瘤和促生长作用明显减弱。 收起