中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 熊露北京中医药大学 2002年博士导师: 张学文共204页

摘要 : 该课题开展中医药对神经干细胞增殖、分化的干预调节研究证实了（1）中药具有脑保护及激发脑内源性神经保护机制、促进神经元埚伤后的再生修复,加速神经功能的重建之双重功能;（2）探索出一条通过中医药干预内源性神经保护机制,促进脑缺血再灌注损伤的... 展开

关键词 : 脑脉康缺血性中风

2. 血竭素高氯酸盐通过内质网应激诱导肝细胞癌凋亡的机制研究

[学位论文] 武家成吉林大学 2021年博士导师: 张学文共128页

摘要 : 目的：肝细胞癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率在世界范围内位居第六位，每年新增病例数超过84万，尽管目前针对肝细胞癌的治疗方式多种多样，包括手术治疗、介入治疗、消融治疗以及化学药物治疗及分子靶向治疗等，但总体治疗效果不... 展开目的：肝细胞癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率在世界范围内位居第六位，每年新增病例数超过84万，尽管目前针对肝细胞癌的治疗方式多种多样，包括手术治疗、介入治疗、消融治疗以及化学药物治疗及分子靶向治疗等，但总体治疗效果不佳，总体五年生存期仅18%，每年因肝细胞癌死亡人数超过78万。因此，如何改善肝细胞癌预后是人们亟待解决的难题。手术切除是临床上针对肝细胞癌最基本的治疗方式，但由于其恶性程度高，发展隐匿等特点，绝大多数病例在确诊时已无法行根治性手术，且术后极易发生复发及转移，因此药物治疗成为目前抗肝细胞癌治疗的重要手段。虽然目前已经出现了以索拉菲尼为代表的多种抗肝癌药物，但效果并不理想，开发新型抗肝癌药物已成为研究者们关注的热点。细胞凋亡是程序性细胞死亡最重要的方式之一，是通过在生理和病理条件下有序协调的细胞程序而最终发生的主动性死亡，其过程受到严密的调控。在正常生理状态下，通过细胞凋亡能去除衰老及异常细胞，对进化、维持机体内环境稳态及器官发育存在重要意义。然而在某些病理条件下，细胞凋亡调节异常也能够导致多种疾病，包括肿瘤、神经退行性变等。根据凋亡信号启动途径的不同，细胞凋亡主要分为外源性凋亡及内源性凋亡，也称为死亡受体凋亡途径及线粒体凋亡途径，两者通过不同的级联信号传导最终均以激活caspase-3等蛋白而执行凋亡改变。通过各种方式诱导肿瘤细胞凋亡是达到抗肿瘤目的重要方式，其中，通过开发新颖的药物直接作用于肝癌细胞并选择性的诱导肝癌细胞凋亡是目前抗肝癌药物研发的重要方向。血竭素高氯酸盐是人工合成的类血竭素样的黄酮类化合物，其药用价值已经被多项研究证实，包括对组织愈合，创面修复及抗糖尿病方面存在一定作用。然而目前，其抗肿瘤作用已成为其药物研究的焦点。目前通过部分体外试验初步证实其在体外对人宫颈癌、肺癌、乳腺癌等存在抑制作用，且其抗肿瘤作用的机制主要以其诱导肿瘤细胞凋亡为主。然而，目前对血竭素高氯酸盐的抗肿瘤作用机制研究并不深入，且其是否对肝细胞癌存在有效的抗癌作用尚未有研究明确证实，因此，我们将通过体内外实验探索血竭素高氯酸盐对肝细胞癌的抗癌作用，并进一步探索其抗癌机制，为研发新颖的抗肝细胞癌药物提供依据。方法： 1、通过MTT法、Hoechst33342、流式细胞仪凋亡检测以检测血竭素高氯酸盐对肝癌细胞及正常肝细胞的作用。 2、通过电子显微镜观察肝癌细胞在血竭素高氯酸盐的作用下，细胞器形态学发生的改变。 3、通过转录组测序分析肝癌细胞在血竭素高氯酸盐的作用下，转录水平上发生的改变。 4、通过MTT法、WesternBlot检测、流式细胞仪凋亡检测、流式细胞仪线粒体膜电势检测等检测血竭素高氯酸盐对肝癌细胞凋亡通路、内质网应激通路以及mTORC1通路的影响，并通过加入相应信号通路抑制剂分析各通路上下游关系。 5、建立肝癌裸鼠移植瘤模型，测量记录在肿瘤在血竭素高氯酸盐作用下体积变化，并记录小鼠体重变化。 6、HE染色观察移植瘤及其他重要器官组织的病理结构改变。 8、TUNEL染色检测移植瘤组织凋亡情况。 7、免疫组化检测移植瘤内p-4EBP1、p-PERK及CHOP的表达。结果： 1、血竭素高氯酸盐在体外能够使人肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B及Huh-7细胞活力显著下降，且对人正常肝细胞L02的细胞毒性明显小于肝癌细胞系。 2、通过Hoechst染色、流式细胞仪凋亡检测及WesternBlot发现血竭素高氯酸盐在体外能够诱导肝癌细胞凋亡，且细胞活力的抑制及细胞凋亡率能够被凋亡抑制剂Z-VAD-FMK所逆转。 3、血竭素高氯酸盐对肝癌细胞系在转录组层面上诱导巨大变化，涉及多种生物学过程及信号通路，包括内质网应激、内源性凋亡及mTORC1信号激活等。 4、在电子显微镜下观察血竭素素高氯酸盐能够诱导肝癌细胞线粒体肿胀、内质网扩张、溶酶体增多等改变。 5、通过流式细胞仪线粒体膜电势检测及WesternBlot检测发现血竭素高氯酸盐能够诱导肝癌细胞线粒体膜电势降低，并诱导Bax及Bcl-2表达比例失衡及caspase-9活化。 6、通过WesternBlot检测发现血竭素高氯酸盐激活肝癌细胞内质网应激，PERK-ATF4-CHOP信号通路被显著激活，在应用4-PBA抑制内质网应激信号的同时，其诱导的线粒体途径凋亡信号得到逆转。 7、通过WesternBlot检测发现血竭素高氯酸盐能够激活肝癌细胞mTORC1信号，通过应用Torin-1抑制mTORC1的激活，能够逆转其诱导的内质网应激及下游凋亡信号。 8、血竭素高氯酸盐能够在体内抑制肝癌细胞的生长，且对裸鼠体重无明显影响，通过HE染色观察肿瘤及重要器官的病理结构发现，血竭素高氯酸盐能够诱导肝癌移植瘤组织结构紊乱，坏死程度加重，且对肝、肺、肾、心、脑无明显毒性作用。 9、应用TUNEL法对肿瘤切片进行检测发现血竭素高氯酸使移植瘤组织TUNEL凋亡染色显著增强。 10、通过免疫组化检测，发现血竭素高氯酸盐能够上调移植瘤内mTORC1通路及内质网应激通路关键蛋白的表达。结论： 1.血竭素高氯酸盐在体内及体外均能够显著抑制肝癌细胞的生长，并对正常细胞及组织毒性较小。 2.血竭素高氯酸盐能够激活肝癌细胞内质网应激信号通路，并介导诱发内源性凋亡。 3.血竭素高氯酸盐能够激活mTORC1，并通过激活内质网应激分支信号通路PERK-ATF4-CHOP介导下游凋亡信号。收起

关键词 : 血竭素高氯酸盐肝细胞癌内质网应激细胞凋亡

3. KRAS调控FGF21表达对胰腺癌细胞恶性表型影响及治疗的研究

[学位论文] 曹黎东吉林大学 2022年博士导师: 张学文共127页

摘要 : 胰腺癌作为恶性程度最高、预后最差的几种癌症之一，也是常见的癌症相关死亡的主要原因之一。从胰腺癌的病理分型来看，胰腺导管腺癌(PDAC)占全部类型的90%。而KRASmutant基因突变是PDAC发生的过程中最为常见的突变，KRAS突变后持续地激活了下游的信号... 展开胰腺癌作为恶性程度最高、预后最差的几种癌症之一，也是常见的癌症相关死亡的主要原因之一。从胰腺癌的病理分型来看，胰腺导管腺癌(PDAC)占全部类型的90%。而KRASmutant基因突变是PDAC发生的过程中最为常见的突变，KRAS突变后持续地激活了下游的信号通路，主导着PDAC的恶性行为。由于KRAS蛋白的分子结构除了GTP结合位点外，无其余有用的口袋，直接作用于KRAS的小分子抑制剂迟迟无法应用，KRAS也一直被称为“不可成药”的靶点。近来，针对KRASG12C位点突变的新型小分子抑制剂AMG510在非小细胞肺癌患者中初见成效，但AMG510仅针对KRASG12C位点，而对于在胰腺癌患者中更为常见的KRASG12D位点没有作用；因此，明确KRASG12D在PDAC中的作用机制同时对其进行调控对于PDAC的治疗具有极为重要的意义。碳水化物是PDAC的主要供能物质，不同于正常组织，PDAC选择了更高比例的糖酵解作为其主要供能方式，糖酵解的中间产物及快速的能量产生提供了PDAC生长、增殖、迁移和侵袭过程所需要的原料和底物，因此我们认为高度糖酵解的特性至少可以提示PDAC的恶性程度。成纤维生长因子(FGF)家族被发现可以诱导有丝分裂的发生，延长细胞的生存时长，同时也参与多种生物过程。其中，FGF21被发现在脂肪细胞中可促进GLUT-1对细胞外葡萄糖的吸收，相对地促进糖酵解的进程；胰腺来源的FGF21还可以维持肥胖小鼠的能量和代谢稳态。在肿瘤形成的早期，KRASG12D的突变下调了胰腺来源的FGF21的表达，同时外源性的FGF21可以逆转高脂饮食诱发KRASG12D突变小鼠胰腺癌的发生。但是在胰腺癌的发展阶段，KRASG12D对于FGF21的调控作用以及其下游对PDAC恶性表型的作用及其机制尚未可知。目的：本研究使用了两株具有KRASG12D突变的PDAC细胞系，PANC-1以及AsPC-1，基于siKRAS的转染技术瞬时沉默两株细胞系中的KRASG12D表达，进而对其糖酵解水平、增殖、迁移和侵袭能力等恶性表型进行评估；接着利用siFGF21转染及FGF21慢病毒转导两组细胞系，评估FGF21对于KRASG12D细胞系恶性表型的影响，进一步探讨在胰腺癌细胞系中KRASGl2D与FGF21之间的调控关系；随后，我们通过共转染siKRAS和siFGF21的手段试图靶向基因调控，对PDAC进行基因治疗。方法：首先利用TCGA数据库，对胰腺癌相关数据进行挖掘，利用Spearman相关性分析探究KRAS、FGF21和KLB之间的相关性；接着利用Western Blot和PCR技术检测胰腺癌细胞系和正常胰腺导管上皮中蛋白表达变化；通过RNAi转染技术检测胰腺癌细胞系中关键分子的表达；构建皮下裸鼠移植瘤模型，给予纳米核酸治疗。结果： (1)依据肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库对KRAS，FGF21，KLB，FGFR的PDAC患者进行生存分析发现，高表达KRAS的PDAC患者具有更短的生存期，而FGF21和KLB仅在早期PDAC患者中表达，FGFR的表达不会影响PDAC患者生存状况。利用Spearman相关性分析发现KRAS和FGF21、KLB成负相关，KRAS和FGFR成正相关。 (2)检测两株KRASG12D突变的PDAC细胞系（PANC-1和AsPC-1）和人的胰腺导管上皮（HPDE6-C7）细胞系的蛋白和mRNA表达情况，相较于HPDE6-C7，AsPC-1和PANC-1细胞具有明确的KRASG12D位点突变以及更高表达的KRAS和糖酵解相关分子以及更低的FGF21及其共受体KLB表达。经过不同的处理方式（糖酵解抑制或无糖培养）处理各组细胞后，检测其增殖能力，CCK-8结果示相比于HPDE6-C7，AsPC-1和PANC-1组对于葡萄糖的缺乏和糖酵解的抑制更为敏感。 (3)利用RNAi技术，对KRASG12D的表达进行调控。通过凝胶阻滞实验验证脂质体对siKRAS的装载效果，通过TEM透射电镜验证组装后复合物形貌和粒径大小，结果显示当脂质体和siKRAS质量比为2∶1时，脂质体和siKRAS完全组装，粒径约为200nm。接着利用倒置荧光显微镜和流式细胞术等手段分析复合物的入胞效率，发现入胞效率接近100%。RT-qPCR结果显示siKRAS纳米复合体特异地诱导了mRNA的沉默。 (4)检测培养液中的葡萄糖和乳酸含量，发现转染siKRAS引起了葡萄糖消耗和乳酸产生的减少；同时，经过CCK-8等实验发现转染了siKRAS后引起PDAC细胞生长和增殖能力减弱；划痕和Transwell侵袭的结果展示siKRAS损害其迁移和侵袭能力。Western Blot等方法证明了KRAS通过激活Raf/Erk/HIF-1α调控糖酵解过程，同时表明下调KRASG12D伴随着FGF21的表达增高。 (5)构建稳定过表达FGF21的AsPC-I细胞株，发现该细胞株展现出更强的增殖、迁移和侵袭能力。分析其蛋白表达变化还发现该细胞KRASG12D的高表达以及下游Raf/Erk/HIF-1α通路的激活；以及KRASG12D的直接调控因子SOS-I和KLB的高表达。接着，敲减FGF21后发现，siFGF21的转染对AsPC-1的恶性表型无显著影响。蛋白免疫印迹结果显示FGF21的敲减不影响KRASG12D的表达和激活，同样也不影响SOS-I的表达含量。 (6)在AsPC-I中共转染siKRAS-siFGF21并评价其恶性表型的变化，发现共转染siKRAS和siFGF21组有更低的增殖、迁移和侵袭能力和糖酵解过程。构建体内裸鼠胰腺癌移植瘤模型，每三日给予核酸纳米复合物进行基因治疗，结果显示共转染组肿瘤体积最小，生长速度最慢。提示了共转染siKRAS-siFGF21在动物水平对PDAC的治疗效果结论：综上，本论文针对最为常见的突变类型，KRASG12D突变的胰腺癌细胞系，利用寡核酸siKRAS为工具，调控KRASG12D的表达从而评估KRASG12D对于AsPC-1、PANC-1恶性表型的影响；同时利用siFGF21和FGF21过表达病毒为工具，探索FGF21对PDAC细胞恶性表型的影响以及FGF21和KRASG12D之间的调控关系；最后我们通过共转染siKRAS-siFGF21的手段靶向PDAC的基因，实现PDAC的基因治疗。收起

关键词 : 胰腺癌 KRAS基因成纤维生长因子恶性表型基因治疗

4. 张学文教授肝热血瘀学术思想及清肝化瘀法治疗高血压病的临床研究

[学位论文] 周海哲中国中医科学院 2018年博士导师: 张学文共127页

摘要 : 目的: 系统整理深入分析张学文教授诊治内科疾病（尤其是脑病）中常用的肝热血瘀学术思想研究;应用中医传承辅助平台（V2.5版），对张学文教授诊治高血压病的医案进行回顾性分析研究，探寻张学文教授辨证高血压病的证候特色、治疗方法、用药规律... 展开目的: 系统整理深入分析张学文教授诊治内科疾病（尤其是脑病）中常用的肝热血瘀学术思想研究;应用中医传承辅助平台（V2.5版），对张学文教授诊治高血压病的医案进行回顾性分析研究，探寻张学文教授辨证高血压病的证候特色、治疗方法、用药规律及用药特点等，总结张学文教授临证高血压病的总体思想和用药特色，以利于更好的传承张学文教授的学术思想和学术经验，为高血压病临床辨治提供可资借鉴的诊治思路。方法: 研究张学文教授学术思想中肝热血瘀部分内容，包括高血压病的中医临床研究概况和肝热血瘀疾病的研究概况、张学文教授肝热血瘀证的学术思想、张学文教授肝热血瘀高血压病的学术思想、张学文教授治疗高血压病的用药规律研究、运用张学文教授肝热血瘀学术思想治疗高血压病的临床研究等主要研究内容。第一部分，在高血压病的中医临床研究概况和以肝热血瘀论治疾病的研究概况中，主要采用文献综述的研究方法，从高血压病的中医命名、高血压病证候规律研究、中医从肝、热、瘀辨证高血压病等方面梳理高血压病目前的中医理论临床概况;也对肝热血瘀病机在临床疾病上的运用情况进行了文献探索。第二部分，在肝热血瘀学术渊源和学术思想特色研究中，通过探究老师的从医经历和医学事业发展过程，分析了老师的肝热血瘀学术渊源。随之深入分析老师肝热血瘀思想机理，由发病原因、脏腑变化、病理机制和病症特点、用药思路和经验等方面，系统而深入的进行探讨分析。并对老师肝热血瘀学术思想在常见脑病如眩晕、中风、头痛、颤证、痫病等疾病的诊疗体现，予以阐述，总结老师的常用诊治方药。第三部分，主要探析张学文教授关于高血压病肝热血瘀的理论。深入分析肝热、瘀血产生的来源，对血脉的影响，产生高血压的机制及肝热血瘀的证候表现，并对张学文教授治疗肝热血瘀证高血压病的思路和用药经验进行整理总结。第四部分，通过收集整理张学文教授诊治高血压病的医案资料，利用中医传承辅助平台（V2.5版），建立张学文教授诊治高血压病医案数据库，录入病历资料和处方数据资料，运用基于关联规则、复杂系统熵聚类等无监督数据挖掘方法进行证候分析、药物频次、组方规律及新处方分析，并对分析结果进行图标或网络可视化展示。第五部分，临床研究，采用随机对照的临床研究方法，选择临床1级、2级高血压病肝热血瘀证患者123例，治疗组62例，对照组61例，纳入病例观察。对两组病例从年龄、性别、病程、体重指数、血脂、血糖等方面进行基线资料的分析，确定具有可比性。两组均采用西药降压药钙离子拮抗剂作为基础降压治疗手段，治疗组加用清肝活血降压汤加减治疗，对照组根据患者血糖、血脂等情况加用相应药物。两组用药均8周。对两组治疗前和治疗后1周、2周、4周、8周时的血压及动态血压情况分别进行统计分析;对两组治疗前后降压疗效、中医证候积分、中医证候改善情况等进行临床疗效评价，并对两组患者治疗前后血脂、血液流变学、同型半胱氨酸、肝肾功进行测定，计算体重指数的变化。结果: 第一部分通过从肝、热、瘀角度论治高血压病的研究进展，发现高血压在中医多归属“眩晕”、“头痛”范畴，与肝火亢盛、阴虚阳亢、阴阳两虚、痰湿壅盛4个中医证型密切相关，在此基础上又衍生出了肝热血瘀证、肝火亢盛证、气虚血瘀等证;还发现高血压病从肝、热、瘀论治，不仅可以从古典医籍中找到理论依据，更有现代名医实践经验、证候生物学基础及中药药理学研究作为支撑，现已成为主流共识。肝热血瘀除论治高血压病外，还能治疗肝癌、骨髓增生性疾病、系统性红斑狼疮等其他多种疾病。第二部分通过对张学文教授的肝热血瘀学术渊源及学术思想的研究，明确张学文教授肝热血瘀的提出，与其幼承庭训即获感性认识，后入科班精学经典理论，师承孟澍江方感清温之妙而重攻温病，临证日久深悟内科病证多有热瘀之候，故而提出肝热血瘀证，并总结了清肝化瘀的整体治疗思路。其次，概括归纳了张学文教授肝热血瘀学术思想。包括:诸因纷扰重情志的病因推究，肝为刚脏易亢热和气血失调多瘀滞的生理基础及病理变化，肝热血瘀诸病现的证候表现，总结热瘀同治的治疗思路和方法。张学文教授认为根据具体辨证情况来清肝化瘀，分别采取疏平补潜共清肝和化凉补通以活血的方法进行，并观察是否兼加他邪及虚实情况灵活用药。再次，梳理总结了张学文教授肝热血瘀学术思想的临床经验总结。第三部分着重介绍张学文教授肝热血瘀证高血压病的学术观点。张学文教授重视脏腑功能的变化，认为五脏功能紊乱是高血压病发生的基础，而肝体易虚，肝失疏泄，郁滞化热或阳热亢盛或阴虚阳亢是关键的病机，并可影响气血和津液的运行，造成血脉瘀滞，脉内气机攻撑，脉管失其柔顺通利，出现血压增高，故气血失调是高血压病的主要病理改变。八纲辨证，明阴阳、分气血、辨寒热、究虚实，认为高血压病病位主要在脉，主脏在肝，涉及心脾肾。瘀和热是高血压病的主要病理因素，肝热和瘀血常贯穿于高血压病全程。肝热可分为肝经郁热、肝阳上亢或阴虚阳亢，故高血压病的主要证型为肝热血瘀证。治疗以清肝化瘀为基础，血脉淤滞，非活血不能化瘀行血，肝热亢盛，可降火滋阴以清肝，脉络郁阻僵硬，需解痉柔脉通络复其畅，故拟定变通天麻钩藤汤和脑清通汤辨证加减治疗。根据病情的兼加情况，配合化湿涤痰、健脾益气、温补脾肾、温阳利水、阴阳双补等法，使脏腑和调，气血调畅，脉络通顺而血压恢复常态。第四部分基于数据挖掘的高血压病用药规律的研究表明，老师诊治的高血压病医案中，证候以肝热血瘀证为首，印证了老师认为的高血压病患者阳热亢盛和血脉瘀滞的观点。研究提炼出老师治疗高血压病常用的药物有天麻、川牛膝、丹参、菊花、生杜仲、钩藤、石决明、磁石、黄芩、生龙骨、栀子等，功效以清肝热，化瘀血，平肝阳，息肝风为主，体现了老师以热瘀从肝论治高血压病的学术观点。五味分析发现老师治疗高血压病用药以甘味药最多，为1063次，占47.65％，着重反应了老师“甘缓治肝”的思想。苦味药紧随其次，苦能降泻，且“苦走血，血结不行者以苦攻之”。四性分析发现寒凉药物总计占总频次的62.67％，体现了老师用凉药治疗热病的思想。通过关联分析，出现频次＞65次的中药组合有98组，如钩藤-天麻，石决明-天麻，生龙骨-天麻，生牡蛎-天麻，丹参-钩藤-天麻，丹参-川牛膝-天麻，丹参-石决明-天麻，钩藤-川牛膝-天麻，菊花-钩藤-天麻，石决明-钩藤-天麻，钩藤-生杜仲-天麻，磁石-川牛膝-天麻等。经过复杂系统熵聚类算法分析，发现老师治疗高血压病的常用药对有桑寄生-白术，桑寄生-茯苓，钩藤-三七粉，熟地-钩藤，黄芩-丹皮，山萸肉-枸杞，山萸肉-天麻，黄芩-石斛，夜交藤-白芷，熟地-枸杞等。基于无监督的熵层次聚类法提取组合治疗高血压病新处方共15条，如白茅根、通草、龙胆草、车前子、山药，蝉蜕、瓜蒌、龙胆草、砂仁、薤白，甘草、旱莲草、玄参、石斛、王不留行，白芍、黄芩、郁金、蝉蜕，茯神、夜交藤、桑寄生、菊花、柏子仁，熟地、山萸肉、地骨皮、黄柏、知母等。分析新处方发现，白茅根、车前子、王不留行、鬼箭羽等老师曾提到化瘀利水的药物，在针对瘀血病机的使用中不可小觑，这也体现了老师的另一重要学术观点“颅脑水瘀论治”。第五部分观察了清肝活血降压汤（变通天麻钩藤汤和脑清通汤的合方）治疗高血压病肝热血瘀证的临床疗效。结果发现两组患者用药后血压即开始下降，两组治疗1周时即与治疗前比较，收缩压与舒张压均有统计学差异(p＜0.05)，治疗2周时两组收缩压和舒张压较治疗前明显下降，与治疗前相比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。且两组降压均已达到临床降压标准。治疗4周、8周时两组降压均趋于稳定，与治疗前相比较，收缩压和舒张压均有极显著差异。两组之间无统计学差异。两组患者治疗前后降压疗效比较，治疗组总有效率98.39％，对照组总有效率98.36％，两组总有效率比较无统计学差异（P＞0.05）。两组中医证候疗效比较时，各项证候改善情况中治疗组总有效率均高于对照组（P＜0.05或P＜0.001），其中在急躁易怒、目赤、口干、胸闷、失眠、心悸、大便异常、溲赤及舌脉象等单项方面，具有极显著性差异（P＜0.001）。两组患者治疗前后的血脂含量、血液流变学、同型半胱氨酸含量、体重指数比较，TC、TG、HDL-C、LDL-C、血清Hcy水平、全血粘度、血浆粘度、红细胞压积等，均具有改善作用，且治疗组改善更明显，两组比较有统计学差异（P＜0.05）。治疗组患者的体重明显降低，与对照组相比，有统计学差异(P＜0.01)。两组患者安全性指标均无异常，均未出现明显的不良反应。结论: 张学文教授肝热血瘀学术思想形成是在长期临证实践的基础上，继承中医经典理论，撷取温病之长，不断思索与创新，并经过数十年临床验证而形成的。老师肝热血瘀证的学术传承脉络清晰，学术渊源深厚，学术思想鲜明独特;肝热血瘀思想具体表现为肝经郁热血瘀、肝阳上亢血瘀、肝肾阴虚血瘀和肝风血瘀四个方面，可见于眩晕、头痛、中风、颤证、痫病等多种脑病中。其病机常可与“热”、“瘀”相关，治疗要热瘀同治。老师认为治疗高血压病肝热血瘀病机尤为多见。故从调理脏腑功能、改善气血运行及解痉通络舒脉多点入手，强调整体观念;辨治时不可忽略痰、虚等病机，随机加减治疗，准确辨证，精准用药，多于后期伴并发症，涉及多脏腑损伤者，更是要补虚泄实，兼顾用药。经过临床研究证明，清肝活血降压汤可以明显降低血压，且在改善患者证候表现、降低血压变异性和维持血压稳定方面更具有优势，清肝化瘀法在调整血脂、改善血液流变学、降低血中同型半胱氨酸等方面，亦明显优越于对照组。收起

关键词 : 高血压病中医病机清肝化瘀法中药治疗临床药理张学文

5. MicroRNA-23a-27a-24-2簇在肝细胞癌中的功能及调控机制研究

[学位论文] 崔梦莹吉林大学 2020年博士导师: 张学文共126页

摘要 : 研究目的: 肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）由于高复发率和频繁转移而成为全世界与癌症相关死亡的第四大最常见原因。对于肝细胞癌的发生发展/侵袭转移的研究一直是热点，但其具体机制至今仍不完全清楚。miR-23a-27a-24-2簇位于人类染... 展开研究目的: 肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）由于高复发率和频繁转移而成为全世界与癌症相关死亡的第四大最常见原因。对于肝细胞癌的发生发展/侵袭转移的研究一直是热点，但其具体机制至今仍不完全清楚。miR-23a-27a-24-2簇位于人类染色体19p13.12，转录后形成3个成熟的miRNAs：miR-23a，miR-27a和miR-24。在miR-23a-27a-24-2簇中，三个miRNAs转录共用一个启动子。然而，在不同组织和细胞中，三个成熟miRNAs表达有时一致，有时不一致。相同的miRNA可以因为作用靶点的不同发挥不同的甚至相反的功能。目前对miRNAs的研究多集中在单一的miRNA上，对于miRNA的整体功能及其调控网络的研究非常有限。本研究将利用CRISPR Cas9基因编辑技术建立miRNA敲除HepG2细胞模型，并在此基础上建立动物模型，分别阐述miR-23a-27a-24-2簇中成熟miRNAs的功能；同时利用CRISPR dCas9（Catalytically dead Cas9，dCas9）技术建立内源性miR-23a-27a-24-2簇转录可调控（转录抑制/转录激活）的HepG2细胞模型，从整体上阐明miR-23a-27a-24-2簇对肝细胞癌增殖/凋亡/侵袭转移的影响及调控机制。研究方法: （1）应用TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库分析miR-23a/miR-27a/miR-24在正常组织及肝癌组织中的表达差异及其与肝细胞癌生存率的关系。（2）细胞模型构建：CRISPR Cas9基因编辑技术构建miR-23a/miR-27a敲除HepG2细胞模型；CRISPR dCas9技术构建内源性miR-23a-27a-24-2簇转录可调控（转录抑制/转录激活）的HepG2细胞模型。（3）miR-23a/miR-27a对肝细胞癌增殖的影响（体外实验：细胞生长曲线/MTT/Clone forming/Soft agar assay/流式细胞周期/BrdU染色；体内实验：NGS mice皮下瘤生长曲线，皮下瘤重量）及机制分析（RNA转录组高通量测序筛选miR-23a/miR-27a候选靶基因及信号网络；靶基因验证：RT-qPCR/Western Blot/双荧光素酶报告基因/RNA免疫共沉淀；信号通路验证：RNA干扰技术联合RNA免疫共沉淀技术）。（4）miR-23a/miR-27a对肝细胞癌凋亡的影响（流式细胞凋亡分析）。（5）miR-23a/miR-27a对肝细胞癌侵袭转移的影响（细胞划痕实验/Transwell assay）及机制分析（Western Blot/免疫组织化学染色/RNA免疫共沉淀）。研究结果: （1）MiR-23a/miR-27a/miR-24三个miRNAs在正常肝组织与肝癌组织间表达均无明显差异，但miR-23a/miR-27a/miR-24高风险组中生存率较低风险组生存率降低（数据来自TCGA数据库）。（2）正常细胞系（HEK293T）中miR-23a/miR-27a/miR-24的表达含量明显低于肿瘤细胞系；肿瘤细胞系中，miR-23a/miR-27a/miR-24在Huh7细胞系中表达量相对较低，而在HepG2/DU145/MDA-MB-231细胞系中表达量相对较高。（3）体外实验证实miR-23a/miR-27a敲除后，细胞增殖减慢，且miR-27a敲除后对HepG2细胞增殖的影响更大；体内实验证实miR-23a/miR-27a敲除后，细胞增殖减慢，且miR-23a与miR-27a在体内环境下对肝细胞癌增殖的影响差异不显著。（4）MiR-23a/miR-27a主要通过促进细胞周期蛋白Cyclin A/Cyclin B的表达，降低phospho-CDK1（Tyr15）的表达促进肝细胞癌增殖；皮下瘤组织免疫组织化学染色结果与体外实验相符，ki67在miR-23a/miR-27a敲除后表达量下降。（5）PURA为RNA-seq联合在线miRNA靶基因预测网站筛选的miR-23a及miR-27a共同的靶基因；E2F targets/G2-M checkpoint/MYC targets/Mitotic targets/DNA repair为Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）富集的基因集；RT-qPCR/Western Blot/双荧光素酶报告基因/RNA免疫共沉淀技术证实PURA为miR-23a及miR-27a的靶基因；RNA干扰技术证实PURA能够部分逆转miR-23a/miR-27a敲除后对HepG2细胞增殖的抑制作用。（6）MiR-23a-27a-24-2簇能够从整体上调节细胞周期G2/M期各个蛋白的表达，其中miR-23a/miR-27a可以通过调节PURA间接调控TTK；miR-23a可以直接调控STAG1，而miR-27a可以通过调节PURA间接调控STAG1。（7）MiR-23a-27a-24-2簇对肝细胞癌凋亡无明显影响。（8）MiR-23a与miR-27a在肝细胞癌侵袭转移方面发挥不同功能。MiR-23a敲除后，HepG2细胞侵袭转移能力增加；而miR-27a敲除后HepG2细胞侵袭转移能力减弱；MiR-23a通过靶向BMPR2抑制Smad1/5/9的磷酸化，下调转录因子Snail，影响上皮及间质标志物的表达，最终抑制肝细胞癌的侵袭转移。研究结论: （1）MiR-23a-27a-24-2簇主要影响肝细胞癌的增殖及侵袭转移。（2）MiR-23a及miR-27a均能够促进肝细胞癌增殖，且miR-27a对肝细胞癌增殖的影响更显著。MiR-23a-27a-24-2簇主要通过调节细胞周期G2/M期的信号网络促进肝细胞癌增殖。（3）MiR-23a及miR-27a在调节肝细胞癌侵袭转移方面发挥不同功能。MiR-27a促进肝细胞癌侵袭转移，而miR-23a通过靶向BMPR2抑制Smad磷酸化，抑制肝细胞癌侵袭转移。收起

关键词 : 肝细胞癌非编码RNA-23a-27a-24-2簇癌细胞生物学调控机制

6. CRNDE/miR-33a-5p/CDK6轴调控肝癌增殖的机制研究

[学位论文] 林超吉林大学 2020年博士导师: 张学文共125页

摘要 : 原发性肝癌作为中国常见的恶性肿瘤，位于中国肿瘤致死原因的第三位。其中肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）约占肝癌类型85%-90%。发病隐匿，早期没有典型症状，多数患者发现时已失去了根治性治疗的时机，因此，深入了解HCC发病的分子机制... 展开原发性肝癌作为中国常见的恶性肿瘤，位于中国肿瘤致死原因的第三位。其中肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）约占肝癌类型85%-90%。发病隐匿，早期没有典型症状，多数患者发现时已失去了根治性治疗的时机，因此，深入了解HCC发病的分子机制，有助于肿瘤的早期诊断及降低术后复发几率。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一类长度超过200个核苷酸，并且没有蛋白质编码能力的RNA，随着研究的进展发现，大量的研究发现LncRNA能够调节基因表达来参与肿瘤的进程，成为潜在的肿瘤标志物与分子治疗靶点。CRNDE（Colorectal neoplasia differentially expressed）是最早被发现在结肠癌患者的癌组织中呈高表达的一种LncRNA，其具有组织表达特异性，在乳腺，睾丸，支气管及腮腺等部位高表达，促进肿瘤的增殖，与患者临床预后密切相关，但在肝癌中的作用机制仍不明确，有文献报道在肝癌中其可能参与细胞周期控制。CDK6（cyclin-dependent kinase6,CDK6）是参与细胞周期调控的重要蛋白，研究发现，CDK6的失衡会影响细胞的周期进程，从而调节肿瘤细胞的增殖。通过生物信息学分析，发现，miR-33a-5p与CRNDE存在靶基因关系；同时miR-33a-5p与CDK6也存在结合位点。在肝癌中，CRNDE可能通过调控miR-33a-5p影响CDK6的表达，进而调控肿瘤的增殖，可能成为肝癌治疗的潜在靶点。目的： 1、检测LncRNA CRNDE在肝癌组织中的表达情况，明确其与临床病理特征的相关性； 2、研究CRNDE/miR-33a-5p/CDK6轴调控HCC增殖的作用机制。方法与结果： 1.通过检测30对肝癌及癌旁组织中LncRNA CRNDE的表达情况，结果表明，肝癌组织中CRNDE表达明显高于癌旁组织，根据PCR结果将30个肝癌患者分为高表达组和低表达组，CRNDE高表达与肿瘤TNM分期、是否存在微血管侵犯密切相关。 2.通过GEPIA数据分析发现，在肝细胞肝癌中，CRNDE高表达患者的总体生存期短于CRNDE低表达患者的总体生存期。利用30例临床患者资料，发现LncRNA CRNDE、微血管浸润是肝癌患者不良预后的独立因素。 3.通过沉默Huh-7细胞中CRNDE的表达，发现CRNDE的下调显著抑制肝癌细胞Huh-7的增殖、迁移及侵袭。 4.利用双荧光酶素检测发现共转染miR-33a-5p与包含野生型CRNDE的双荧光素酶报告基因载体可引起报告基因荧光强度明显下降，另外下调CRNDE表达的Huh-7细胞，其miR-33a-5p表达明显升高，表明CRNDE靶向作用于miR-33a-5p，并下调其在肝癌中的表达，从而发挥作用，为进一步验证此结果，通过qRT-PCR检测了30对肝癌、癌旁组织，以及对肝癌细胞进行了检测，发现miR-33a-5p在癌组织及肝癌细胞中低表达。过表达miR-33a-5p抑制肝癌细胞Huh-7的增殖。 5．为验证CRNDE通过CRNDE/miR-33a-5p/CDK6轴在HCC中发挥作用，发现通过双荧光酶测定法将miR-33a-5p与野生型CDK6共转染双荧光酶素报告载体可导致报告基因的荧光强度明显下降，说明miR-33a-5p可以与CDK6结合，通过Western Blot检测发现，CDK6在癌组织表达明显高于癌旁组织，肝癌细胞Huh-7中的表达也明显高于正常人肝细胞L02中的表达。而通过下调CRNDE或过表达miR-33a-5p可以明显降低CDK6的表达，说明CRNDE及miR-33a-5p为CDK6的上游，进一步过表达CDK6发现，过表达CDK6可以明显促进Huh-7细胞的增殖，并且其作用可以被miR-33a-5p mimics所抵抗，说明CRNDE可以通过调控CDK6促进肝癌细胞的增殖。 6.为了研究CRNDE和miR-33a-5p在体内的作用，通过注射sh-CRNDE，miR-33a-5p mimics及其空转染组转染的Huh-7细胞建立异种移植小鼠模型。a结果表明sh-CRNDE和miR-33a-5p mimics组显著抑制肿瘤生长，肿瘤体积减少。结论： 1．LncRNA CRNDE在肝细胞肝癌组织中过表达，与肿瘤TNM分期、是否存在微血管侵犯显著相关，与患者预后相关，是患者预后的独立因素； 2．LncRNA CRNDE通过CRNDE/miR-33a-5p/CDK6轴促进肝癌的增殖，它可能成为肝细胞肝癌的新肿瘤标志物和分子生物治疗靶点。收起

关键词 : 肝癌 CRNDE基因非编码RNA-33a-5p CDK6蛋白癌细胞增殖发病机制

7. 长链非编码RNA DLGAP1-AS1促进肝细胞癌生长和转移的机制研究

[学位论文] 林叶吉林大学 2020年博士导师: 张学文共117页

摘要 : 原发性肝癌是全球常见的致死恶性肿瘤，严重影响着人民群众的生命健康。目前肝癌的总体预后不理想，其主要原因是发病隐匿、恶性程度高、易复发以及易转移。因此，研究肝癌的生长以及复发转移的分子机制，为寻找有效的预测标志物以及潜在的治疗靶点提... 展开原发性肝癌是全球常见的致死恶性肿瘤，严重影响着人民群众的生命健康。目前肝癌的总体预后不理想，其主要原因是发病隐匿、恶性程度高、易复发以及易转移。因此，研究肝癌的生长以及复发转移的分子机制，为寻找有效的预测标志物以及潜在的治疗靶点提供理论依据，对于早期诊断、早期治疗具有重大的临床意义。 JAK/STAT信号通路是一个进化保守的信号通路，受许多细胞因子、干扰素以及生长因子激活，控制细胞的生长以及分化。在生理状态下，IL-6/JAK/STAT3信号通路激活，调控细胞周期D1蛋白和p21分子，启动并维持了肝脏的再生。另外，IL-6/JAK/STAT3通路激活后可上调抗凋亡蛋白，保护肝脏细胞免受凋亡介导的损伤。然而，JAK/STAT3的持续性激活引起非可控性炎症反应，导致慢性炎症疾病的发生以及促进肿瘤疾病的进展。已经发现，IL-6/JAK/STAT3信号通路的持续性激活一方面可促进肿瘤细胞增殖、存活、侵袭以及转移，另一方面也抑制抗肿瘤的免疫反应。然而，IL-6/JAK/STAT信号通路在肝癌持续性激活的机制尚不完全清楚。 Wnt/β-Catenin信号通路也是高度保守的信号通路,在多种生物学过程和许多疾病的发病机制中发挥重要作用,如早期的胚胎发育、器官形成、干细胞维持、伤口愈合和以及组织内稳态的维持。Wnt信号通路的异常影响许多病理过程，特别是在癌症和纤维化中。Wnt信号通过靶向调控细胞周期蛋白，影响细胞分裂。越来越多的证据表明，Wnt通路的异常激活在肝癌发生发展中起重要作用，它影响肿瘤细胞干性特征、耐药性、肿瘤进展和转移。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs，lncRNAs）是近期科学研究的热点。LncRNAs是一类长度超过200个核苷酸的RNA转录物，其蛋白质编码能力较差或没有编码能力。最近，越来越多的证据证明，lncRNAs在调节许多疾病的多种过程中发挥着显著的作用，包括肝癌等癌症。LncRNA可影响免疫反应、肝再生以及氧化还原信号，在调节肝脏微环境和慢性肝病中起着关键作用。lncRNA的失调会导致慢性肝炎、肝脏增生和氧化应激，最终导致肝癌的发生和发展。已经发现lncRNA可促进肝癌的增殖，改变肿瘤细胞的代谢状态，提高肿瘤细胞的干性特征，促进侵袭和转移。因此，深入研究lncRNA对肝癌的生物学行为的影响，为阐明肝癌生长和转移的分子机制提供理论依据，有助于未来靶向药物的研发。本课题的研究围绕肝癌临床问题即肿瘤的快速生长及转移的特性，结合当前研究热点即长链非编码RNA在肿瘤的恶性进展中扮演着重要角色，提出科学假说，肝癌的生长及转移可能受某些长链非编码RNA的调控，激活信号通路促进肝癌的生长及转移。在本研究中，我们发现了长链非编码RNA（DLGAP1-AS1）在肝癌细胞及组织中高表达，而且其高表达预示着肝癌患者具有更短的总生存时间。随后我们利用细胞生物学实验证明了DLGAP1-AS1可增强肝癌的生长，促进肿瘤细胞上皮间质转换。小鼠动物学实验证实了DLGAP1-AS1促进肝癌皮下瘤的生长以及增加肺转移灶的数目。进一步的分子生物学实验发现，DLGAP1-AS1通过与miR-26a/b-5p结合，一方面解除miRNA对IL-6的抑制，上调IL-6的表达，激活JAK2/STAT3信号通路；另一方面DLGAP1-AS1与miR-26a/b-5p结合，解除miRNA对CDK8及LRP6的抑制，激活Wnt/b-catenin信号通路，最终促进肝癌的生长及转移。我们的研究结果表明，DLGAP1-AS1参与了肝癌体内外肿瘤发生和转移的调控，提示DLGAP1-AS1可能成为肝癌治疗的潜在靶点。收起

关键词 : 肝细胞癌细胞生长细胞转移长链非编码核糖核苷酸两面神激酶2 &beta -连环蛋白 Wnt信号通路

8. miR-23a-3p通过靶向原钙粘蛋白17促进肝细胞癌G1/S细胞周期转化的作用研究

[学位论文] 项一恩吉林大学 2020年博士导师: 张学文共113页

摘要 : 目的： microRNA是内生性短链非编码RNA，主要在转录后水平通过促进mRNA降解和抑制mRNA翻译来调节靶基因的表达。一个microRNA可以靶向多个基因，一个基因也可以被多个microRNA靶向抑制，microRNA还可以被lncRNA和环状RNA等靶向抑制。lncRNA、环... 展开目的： microRNA是内生性短链非编码RNA，主要在转录后水平通过促进mRNA降解和抑制mRNA翻译来调节靶基因的表达。一个microRNA可以靶向多个基因，一个基因也可以被多个microRNA靶向抑制，microRNA还可以被lncRNA和环状RNA等靶向抑制。lncRNA、环状RNA、microRNA和mRNA组成复杂的调控网络对各种信号通路的关键分子起到重要的调控作用。microRNA与细胞生长、分化、细胞周期、凋亡和代谢等一系列生物过程密切相关。microRNA表达异常还可以引起包括癌症和心血管疾病在内的多种疾病。多篇文献报道miR-23a-27a-24-2簇在肝细胞癌中表达异常增高，与肝细胞癌的复发、转移密切相关。miR-23a-3p是miR-23a-27a-24-2簇的重要组成分子，先前的研究表明miR-23a-3p可以促进肝细胞癌生长和转移，调节肝癌细胞的化学敏感性，还可以抑制肝癌细胞凋亡。但miR-23a-3p与肝细胞癌细胞周期之间是否存在调控关系尚不明确。原钙粘蛋白属于钙粘蛋白超家族的亚家族之一，功能尚不完全清楚。其表达由于基因突变和启动子甲基化等原因在乳腺癌、淋巴瘤、宫颈癌、亨廷顿病和非小细胞肺癌等疾病中常常被沉默。原钙粘蛋白PCDH17属于抑癌基因，位于人类染色体13q21.1上。PCDH17在急性髓性白血病、喉部鳞状细胞癌、膀胱癌、肝细胞癌和胃癌等多种癌症中表达明显下调。PCDH17可以诱导肿瘤细胞凋亡和自噬，但在胃癌和结肠癌中常常被甲基化。在肝细胞癌中PCDH17表达沉默可以通过激活EGFR/MEK/ERK信号通路促进肿瘤细胞的侵袭和转移。然而，PCDH17对肝细胞癌细胞周期的调节作用尚不明确。本研究检测了人类肝细胞癌和邻近正常肝组织中miR-23a-3p和PCDH17的表达水平。此外还通过一系列体外实验探究了肝细胞癌中miR-23a-3p与细胞周期、PCDH17与细胞周期以及miR-23a-3p与PCDH17的关系。miR-23a-3p是否通过PCDH17调控肝细胞癌细胞周期也得到了验证。最后，通过体内实验对miR-23a-3p与肿瘤生长的关系进行了探究。方法：（1）通过RT-qPCR和western blotting对人类肝细胞癌和邻近正常肝组织中miR-23a-3p和PCDH17的表达水平进行了检测，并通过线性回归分析了miR-23a-3p和PCDH17的相关性。（2）通过RT-qPCR检测了Hep3B，Huh-7和HepG2细胞系中miR-23a-3p的表达水平，筛选出Hep3B和HepG2用于后续实验。通过RT-qPCR检测了Hep3B转染miR-23a-3p mimics和HepG2转染miR-23a-3p inhibitor的效率。通过CCK-8细胞活性检测、流式细胞周期检测、EdU渗入S期细胞数量检测和western blotting等体外实验探究了miR-23a-3p对肝细胞癌细胞周期的调节关系。（3）通过CCK-8细胞活性检测和流式细胞周期检测等体外实验探究了PCDH17对肝细胞癌细胞周期的调节关系。（4）Hep3B转染miR-23a-3p mimics和HepG2转染miR-23a-3p inhibitor后，通过RT-qPCR和western blotting检测了PCDH17的表达水平。通过生物信息学分析预测了PCDH173’UTR中miR-23a-3p的特异性结合位点。最后通过双荧光素酶报告实验确认了miR-23a-3p和PCDH17的直接靶向关系。（5）分别对Hep3B和HepG2转染PCDH17siRNA，NC siRNA，PCDH17过表达质粒或空载体，并通过western blotting检测了转染效率。对Hep3B共转染miR-23a-3p mimics或NC mimics和PCDH17过表达质粒或空载体。对HepG2共转染miR-23a-3p inhibitor或NC inhibitor和PCDH17siRNA或NC siRNA。共转染后通过CCK-8细胞活性检测、流式细胞周期检测、EdU渗入S期细胞数量检测和western blotting等体外实验探究了miR-23a-3p是否通过靶向PCDH17来调节肝细胞癌细胞周期。（6）分别向裸鼠左侧腋窝皮下注射稳定转染pre-miR-23a的Hep3B细胞和稳定转染miR-23a-3p sponge的HepG2细胞，并测量肿瘤生长速率。处死裸鼠后，取肿瘤组织进行HE染色计算坏死、凋亡细胞的数量，并通过IHC染色进一步确认miR-23a-3p和PCDH17的靶向关系。结果：（1）与对照组相比，肝细胞癌组织中miR-23a-3p的表达水平明显上调，PCDH17mRNA和蛋白的表达水平均明显下调。miR-23a-3p与PCDH17mRNA的水平负相关。（2）在Hep3B，Huh-7和HepG2细胞系中，Hep3B的miR-23a-3p表达水平最低，HepG2的miR-23a-3p表达水平最高。Hep3B细胞转染miR-23a-3p mimics后miR-23a-3p的水平明显增加，而HepG2细胞转染miR-23a-3p inhibitor后miR-23a-3p的水平明显降低，表明转染是有效的。CCK-8实验中，转染48h和72h后，Hep3B的活性明显增加，而HepG2的活性明显降低。流式细胞周期检测中，转染miR-23a-3p mimics后Hep3B S期的细胞数量明显增加，G1期的细胞数量明显减少。而miR-23a-3p inhibitor转染HepG2的结果与Hep3B相反。EdU渗入实验的结果与流式细胞周期的结果相似。western blotting检测中，转染miR-23a-3p mimics后Hep3B细胞内cyclin D1，cyclin E，CDK2，CDK4，p-p27和p-RB的水平明显上调，而p27的水平明显下调。而miR-23a-3p inhibitor转染HepG2的结果与Hep3B相反。但是，RB的表达水平都没有明显改变。（3）PCDH17siRNA转染Hep3B Cell后，CCK-8实验中，细胞活性明显增加。流式细胞周期检测中，S期细胞比例明显增加，G1期细胞比例明显减少。HepG2的转染实验结果与之相反。（4）miR-23a-3p mimics降低PCDH17mRNA和蛋白的水平而miR-23a-3pinhibitor增加PCDH17mRNA和蛋白的水平。miR-23a-3p mimics和携带PCDH17野生型3’UTR的质粒共转染后，细胞荧光素酶活性明显降低，表明miR-23a-3p和PCDH17存在直接靶向关系。（5）转染PCDH17siRNA后PCDH17的水平明显降低。相反地，转染PCDH17过表达质粒后PCDH17的水平明显增加。CCK-8实验中，与miR-23a-3p mimics+空载体组相比，miR-23a-3p mimics+PCDH17过表达明显使Hep3B的细胞活性降低。流式细胞周期检测中，miR-23a-3p mimics+PCDH17过表达组Hep3B的S期细胞数量明显减少。EdU渗入实验的结果与流式细胞周期的结果相似。western blotting检测中，转染miR-23a-3p mimics和PCDH17过表达质粒的Hep3B细胞Cyclin D1和cyclin E的表达水平明显下调。HepG2的转染实验结果都和Hep3B相反。（6）体内实验表明注入裸鼠皮下的稳转pre-miR-23a的Hep3B细胞的生长速率明显加快，而稳转miR-23a-3p sponge的HepG2细胞的生长速率明显降低。HE染色显示转染pre-miR-23a的Hep3B细胞生长密集，但转染miR-23a-3p sponge的HepG2细胞坏死和凋亡较多。IHC检测中，转染pre-miR-23a的Hep3B细胞PCDH17的水平明显降低，而转染miR-23a-3p sponge的HepG2细胞PCDH17的水平明显增加。结论：（1）肝细胞癌组织中miR-23a-3p的表达水平明显上调，PCDH17的表达水平明显下调，二者呈负相关。（2）miR-23a-3p可以促进肝细胞癌G1/S细胞周期转化。（3）PCDH17可以抑制肝细胞癌G1/S细胞周期转化。（4）PCDH17为miR-23a-3p的直接靶基因。（5）miR-23a-3p通过靶向PCDH17促进肝细胞癌G1/S细胞周期转化。（6）体内实验表明miR-23a-3p可以促进肝细胞癌生长。收起

关键词 : 肝细胞癌短链非编码RNA-23a-3p 原钙粘蛋白17 癌细胞周期转化病理机制

9. Mettl3/m6A/DUXAP8轴通过激活MAPK/ERK通路诱导肝细胞癌索拉非尼耐药机制的研究

[学位论文] 刘泽锋吉林大学 2022年博士导师: 张学文共111页

摘要 : 研究背景: 肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一.在中国,因HCC导致的死亡人数在所有恶性肿瘤中位居第二位,仅次于肺癌.目前临床上针对HCC的最佳治疗方案是根治性手术,但是由于HCC具有恶性程度高、疾病进展迅速等... 展开研究背景: 肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一.在中国,因HCC导致的死亡人数在所有恶性肿瘤中位居第二位,仅次于肺癌.目前临床上针对HCC的最佳治疗方案是根治性手术,但是由于HCC具有恶性程度高、疾病进展迅速等特点,因此很多病例在发现时已经失去了手术的机会.即使能够手术治疗,术后的复发率和转移率也非常高.这种情况下,包括化疗、靶向治疗等综合性治疗方式就成为了不可替代的关键环节.但是由于HCC对大部分的化疗药物不敏感,导致HCC的化疗效果不佳.索拉非尼(Sorafenib)是一种酪氨酸激酶抑制剂,它是目前治疗无法切除或远处转移的HCC的一线用药,具有抑制肿瘤细胞增殖和抗血管生成的作用,但是这种作用可能会因为耐药性的出现而丧失.目前我们对于HCC的病因和耐药性出现的机制尚不完全清楚,因此需要更加深入地了解HCC的发生、发展以及耐药性背后的遗传学和表观遗传学机制,以制定更加有效的治疗干预策略. 在本研究中,我们发现在基于索拉非尼治疗的患者源性异种移植瘤(Patientderivedtumorxenograft,PDX)模型中DUXAP8显著上调,而这通常预示着患者预后较差.在HCC中,DUXAP8通过增加m6A甲基化介导的RNA稳定性来维持其表达量的上调.在体内和体外,DUXAP8的水平与HCC增殖、干细胞特征维持和索拉非尼耐药呈正相关.在机制研究中我们发现DUXAP8是通过ceRNA机制竞争性地结合miR-584-5p,从而作为miR-584-5p的分子海绵来调控MAPK1的表达,进而激活MAPK/ERK通路.我们的研究发现可以为HCC患者找到新的预后指标和治疗靶点提供思路. 方法: (1)构建索拉非尼治疗的患者源性异种种植(PDX)模型,应用LncRNA-seq鉴定用生理盐水或索拉非尼处理的P4-PDX之间差异表达的LncRNA. (2)通过RT-qPCR验证HCC组织及肿瘤旁正常组织中DUXAP8的表达情况,并将DUXAP8的表达情况与临床病理参数进行相关性分析,探究DUXAP8表达量与患者预后的关系. (3)通过RT-qPCR验证DUXAP8在七株肝癌细胞系(MHCC-97H,Huh7,HCC-LM3,Bel-7405,SNU-449,SK-Hep-1,SNU-182)和人肝永生化细胞系(THLE-3)中的表达情况,筛选出实验用肝癌细胞系. (4)构建DUXAP8低表达和过表达的HCC细胞模型,通过成球试验、WesternBlot、RT-qPCR探究DUXAP8对HCC细胞干细胞特征的影响;通过集落形成实验、CCK-8检测探究DUXAP8在HCC细胞增殖和对索拉非尼耐药中的作用. (5)构建DUXAP8正常表达和低表达的裸鼠移植瘤模型和肺转移模型,通过检测皮下移植瘤大小和生长曲线、免疫组织化学技术探究DUXAP8在HCC细胞增殖和对索拉非尼耐药中的作用. (6)通过甲基化RNA免疫沉淀qPCR(MeRIP-qPCR)检测HCC细胞和人正常肝细胞中DUXAP8的m6A富集程度,应用TCGA(TheCancerGenomeAtlas)数据库和GEPIA(GeneExpressionProfilingInteractiveAnalysis)数据库分析甲基转移酶样蛋白3(Mettl3)在正常肝组织与HCC组织中的表达差异及其与DUXAP8之间的相关性;构建Mettl3低表达和过表达的HCC细胞模型,通过RT-qPCR、MeRIP-qPCR检测DUXAP8的表达情况和m6A富集程度;通过放射菌素D实验探究Mettl3对DUXAP8稳定性的影响. (7)通过RT-qPCR检测DUXAP8在HCC细胞中的定位,对沉默DUXAP8的HCC细胞进行microRNA-seq,筛选出差异表达的microRNA;结合生物信息学数据库EncyclopediaofRNAInteractomes(ENCORI,previouslyknownasstarBasev2.0),预测能够与DUXAP8靶向结合的microRNA;通过双荧光素酶报告基因(Luciferaseassay)、RNA免疫共沉淀(RIP)、RNA下拉实验(RNApull-down)探究DUXAP8与miR-584-5p的关系. (8)通过成球试验、WesternBlot、RT-qPCR、CCK-8检测探究DUXAP8、miR-584-5p在HCC细胞干细胞特征维持、增殖和对索拉非尼耐药中的作用. (9)对沉默DUXAP8的HCC细胞进行RNA-seq,筛选靶基因并对DUXAP8调控表达的差异基因进行KEGG富集分析;通过双荧光素酶报告基因、WesternBlot、RT-qPCR验证miR-584-5p与MAPK1的关系. (10)通过成球试验、WesternBlot、RT-qPCR、CCK-8检测探究DUXAP8、MAPK1在HCC细胞干细胞特征维持、增殖和对索拉非尼耐药中的作用;通过WesternBlot进行机制分析. 结果: (1)DUXAP8在用生理盐水或索拉非尼处理的P4-PDX之间差异表达的LncRNA中上调明显;与肿瘤旁正常组织相比,DUXAP8在HCC组织中显著高表达;高表达的DUXAP8与肿瘤TNM分期、肿瘤大小、微血管侵犯以及远处转移相关,并且DUXAP8高表达的HCC患者往往预后较差. (2)DUXAP8在七株肝癌细胞系(MHCC-97H,Huh7,HCC-LM3,Bel-7405,SNU-449,SK-Hep-1,SNU-182)中的表达量明显高于其在人肝永生化细胞系(THLE-3)中的表达量;在七株肝癌细胞系中,DUXAP8在Huh7和SNU-449细胞系中表达量相对较高,在SK-Hep-1和HCC-LM3细胞系中表达量相对较低. (3)体外实验证实DUXAP8沉默后降低了HCC细胞的干细胞特征,抑制了HCC细胞的增殖能力,增强了HCC细胞对索拉非尼的敏感性;DUXAP8的过表达则促进了HCC细胞的干细胞特征和增殖能力,同时促进了HCC细胞对索拉非尼的耐药;体内实验证实DUXAP8沉默后,抑制了HCC细胞的增殖能力,增强了HCC细胞对索拉非尼的敏感性,并且抑制了HCC细胞的肺转移能力. (4)MeRIP-qPCR结果显示:HCC细胞系中DUXAP8的m6A富集程度明显高于正常肝细胞系;通过检索TCGA数据库和GEPIA数据库,发现HCC组织中Mettl3的表达水平明显高于对应的正常肝组织,并且Mettl3和DUXAP8的表达水平之间存在显著正相关;在沉默Mettl3的HCC细胞中,DUXAP8的表达水平显著降低,DUXAP8的m6A富集程度也出现了下降,同时降低了DUXAP8的稳定性;在过表达Mettl3的HCC细胞中,DUXAP8的表达水平相应升高,DUXAP8的m6A富集程度也出现了升高,同时增加了DUXAP8的稳定性. (5)DUXAP8在HCC细胞中的定位主要在细胞质,miR-584-5p为microRNA-seq结合生物信息学数据库EncyclopediaofRNAInteractomes(ENCORI,previouslyknownasstarBasev2.0)筛选的能够与DUXAP8靶向结合的microRNA,通过RT-qPCR、双荧光素酶报告基因、RNA免疫共沉淀、RNA下拉实验证实miR-584-5p为DUXAP8靶向结合的microRNA;RNA干扰技术和共转染技术证实miR-584-5p能够逆转DUXAP8沉默/过表达在HCC细胞干细胞特征维持以及对索拉非尼耐药中的作用. (6)MAPK1是对DUXAP8沉默的HCC细胞进行RNA-seq筛选出的靶基因,MAPK/ERK通路是KEGG富集分析的最主要的相关信号传导通路;通过RT-qPCR、双荧光素酶报告基因证实miR-584-5p在HCC细胞中能够直接靶向MAPK1,RNA干扰技术和共转染技术证实MAPK1能够逆转miR-584-5p沉默/过表达在HCC细胞干细胞特征维持以及对索拉非尼耐药中的作用. (7)WesternBlot结果显示,DUXAP8沉默可以抑制ERK/CREB的磷酸化水平,但是对JNK/p-38的磷酸化水平没有影响,而过表达MAPK1可以消除DUXAP8沉默对ERK/CREB磷酸化水平的抑制作用;过表达DUXAP8可以促进ERK/CREB的磷酸化水平,沉默MAPK1可以消除过表达DUXAP8对ERK/CREB磷酸化水平的促进作用. 结论: (1)DUXAP8在HCC组织中高表达,并且与HCC的恶性程度呈正相关;DUXAP8的过表达促进了HCC细胞的干细胞特征和增殖,并且促进了HCC细胞对索拉非尼的耐药. (2)Mettl3介导的m6A修饰在维持DUXAP8在HCC细胞中的高表达以及稳定性方面发挥着重要的作用. (3)DUXAP8是通过ceRNA机制竞争性地结合miR-584-5p,从而靶向MAPK1,激活MAPK/ERK通路来调控HCC的恶性表型及对索拉非尼的耐药. 收起

关键词 : 肝细胞癌 m6A甲基化修饰耐药性恶性表型 miR-584-5p

10. 苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及功能分析

[学位论文] 田志坚湖南农业大学 2006年硕士导师: 张学文共107页

摘要 : 本研究以苎麻为材料，提取其总RNA并反转录成cDNA，通过设计一对简并引物扩增出纤维素合成酶基因中间片段，然后通过RACE技术分别获得基因3'端包含多聚A尾的序列和5'端大部分序列(尚缺失包括起始密码子在内的约450bp序列)。将三段序列分别测序并拼接成... 展开

关键词 : 苎麻生物学纤维素合成基因克隆反义转化