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1. miR-200c和miR-141在胃癌中表达、功能及其调节机制的研究

[学位论文] 周欣亮河北医科大学 2015年博士导师: 刘巍；单保恩共133页

摘要 : 本研究采用逆转录实时定量聚合酶链反应(quantitative real-timereverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测miR-200家族五个成员在胃癌组织和其配对癌旁非癌组织中的表达，同时检测胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、HGC-27和... 展开本研究采用逆转录实时定量聚合酶链反应(quantitative real-timereverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测miR-200家族五个成员在胃癌组织和其配对癌旁非癌组织中的表达，同时检测胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、HGC-27和胃上皮细胞株GES-1中miR-200c和miR-141的表达，深入分析miR-200c和miR-141的表达水平与胃癌患者临床病理特征、无病生存期(disease-free survival，DFS)及肿瘤标记物CA50、CEA、CA199和CA724的关系。单独或同时进行miR-200c和miR-141的过表达或沉默，并通过CCK-8(Cell-Counting Kit-8 assay)实验、划痕实验和Transwell实验研究miR-200c和miR-141对胃癌细胞株SGC-7901增殖和侵袭、转移能力的影响，利用双荧光素酶报告基因分析检测miR-200c和miR-141对其预测靶基因E盒结合锌指蛋白-1、-2(zincfinger E-box-binding homeobox1/2，ZEB1/2)的靶向作用，采用qRT-PCR和Western-blot检测胃癌细胞株SGC-7901中miR-200c和miR-141对其预测靶基因ZEB1/2及ZEB1/2的抑制基因E-cadherin的影响。同时检测胃癌组织和其配对癌旁非癌组织中miR-200c和miR-141预测靶基因ZEB1和ZEB2的表达情况，分析其与miR-200c和miR-141表达水平的关系。利用亚硫酸氢盐转换-甲基化特异性聚合酶链反应(Bisulfite conversion-specific andmethylation-specific polymerase chain reaction，MSP)和qRT-PCR技术检测胃癌组织和其配对癌旁非癌组织中miR-200c/141簇上游CpG岛的甲基化水平及TGF-β的表达情况，分析其与miR-200c和miR-141表达水平的关系。采用qRT-PCR技术检测TGF-β和去甲基化抗肿瘤药物地西他滨（5-aza-2'-deoxycytidine，5-AdC）对miR-200c和miR-141在胃癌细胞株SGC-7901中表达的影响。主要研究内容和结果如下分为以下几部分展开论述: 第一部分 miR-200家族在胃癌组织和细胞系中的表达及其与临床病理特征和DFS的关系目的:通过检测miR-200家族在胃癌组织和配对癌旁非癌组织中的表达，以及在四种胃癌细胞系和一种正常胃上皮细胞系中的表达，探讨其在胃癌中的表达情况及其与胃癌患者临床病理特征及DFS的关系。方法:采用qRT-PCR技术检测miR-200家族在胃癌组织和配对癌旁非癌组织中的表达，检测miR-200c和miR-141在四种胃癌细胞系和一种正常胃上皮细胞系中的表达情况。结果: 1.miRNA-200家族在胃癌组织和配对的癌旁非癌组织中的表达水平。 2.miR-200c和miR-141在胃癌细胞系及正常胃上皮细胞系中的表达情况。 3.胃癌组织中miR-200c和miR-141的表达与胃癌患者临床病理特征的相关性。 4.miR-200c和miR-141的表达水平与患者DFS呈负相关关系(P=0.002和P=0.012)。结论: 1.miR-200c和miR-141在胃癌组织中的表达显著低于配对癌旁非癌组织，而其他miR-200家族成员没有显著变化中。与正常胃上皮细胞GES-1相比，miR-200c和miR-141的表达在4株胃癌细胞株也显著降低。提示miR-200c和miR-141可能在胃癌的发生发展过程中发挥着重要作用。 2.胃癌组织中miR-200c和miR-141表达与肿瘤侵润深度与脉管瘤栓情况存在显著负相关关系，提示miR-200c和miR-141可能在胃癌的侵袭转移方面发挥重要作用。 3.miR-200c和miR-141可能成为胃癌预后的潜在提示指标。第二部分 miR-200c和miR-141对胃癌细胞生物学行为的影响及其机制研究目的:探讨miR-200c和miR-141在胃癌中的功能及其发挥功能的机制。方法:单独或共同转染miR-200c和miR-141模拟物或是抑制物或是阴性对照，通过CCK-8、细胞划痕实验和细胞侵袭实验观察miR-200c和miR-141在胃癌细胞SGC-7901增殖、侵袭和转移中发挥的作用。运用MicroRNA生物信息学网站和软件，对其可能的作用靶序列进行预测分析，结合miR-200c和miR-141在胃癌细胞中发挥的生物学功能，进行进一步筛选。通过双荧光素酶报告基因分析的方法检测对其预测靶基因靶向作用，采用qRT-PCR和Western-blot检测胃癌细胞株SGC-7901中miR-200c/141簇对其预测靶基因的影响。同时检测胃癌组织和其配对癌旁非癌组织中miR-200c/141预测靶基因的表达情况，分析其与miR-200c和miR-141表达水平的关系。结果: 1.miR-200c或（和）miR-141对胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖能力的影响。 2.miR-200c或（和）miR-141对人胃癌细胞株SGC-7901细胞侵袭转移的影响。 3.双荧光素酶报告系统验证ZEB1和ZEB2为miR-200c/-141的共同靶基因。 4.在胃癌细胞株SGC-7901中过表达miR-200c/141对ZEB1/2和E-cadherin表达的影响。 5.ZEB1和ZEB2在胃癌组织中的表达显著升高(P=0.001;P=0.004)。ZEB1的表达水平与miR-200c表达水平显著负相关（P=0.029），ZEB2的表达水平与miR-200c和miR-141的表达水平显著负相关（P=0.001，＜0.001）。结论: 1.miR-200c/141可抑制胃癌细胞的侵袭转移能力。 2.在胃癌细胞株SGC-7901中，miR-200c/141通过靶向抑制ZEB1和ZEB2的表达，进而诱导E-cadherin的表达升高来发挥其抑制细胞侵袭转移的作用。 3.在胃癌患者中miR-200c/141可能是通过ZEB1和（或）ZEB2途径调控胃癌的发展。第三部分 TGF-β和miR-200c/141 CpG岛甲基化水平对miR-200c/141表达的影响目的:通过检测胃癌组织和配对癌旁非癌组织中TGF-β的表达水平和miR-200c/141 CpG岛甲基化水平，探讨其与miR-200c和miR-141表达水平的相关性。方法:采用qRT-PCR技术从转录水平上检测TGF-β在胃癌组织和配对癌旁非癌组织中的表达;运用MSP方法检测胃癌组织和配对癌旁非癌组织中miR-200c/141 CpG岛的甲基化水平。分析TGF-β表达水平及miR-200c/141 CpG岛的甲基化水平与miR-200c和miR-141水平的相关性。地西他滨和（或）TGF-β处理胃癌细胞株SGC-7901，观察其对miR-200c和miR-141表达的影响。结果: 1.TGF-β在胃癌组织中的表达显著升高(P=0.005)。TGF-β的表达水平与miR-200c和miR-141的表达水平呈显著负相关关系(P=0.003,＜0.001)。 2.胃癌中miR-200c/141 CpG岛的甲基化水平及其与miR-200c/141的相关性。 3.TGF-β与地西他滨对SGC-7901细胞中miR-200c和miR-141表达的影响。 TGF-β诱导胃癌细胞株SGC-7901中miR-200c和miR-14i表达显著降低（P=0.006;P=0.005）。地西他滨诱导胃癌细胞株SGC-7901中miR-200c和miR-141表达显著升高(P=0.013;P=0.027)，并能够缓解由TGF-β诱导产生的miR-200c和miR-141表达的降低(P=0.005;P=0.007)。结论: 1.胃癌中TGF-β的表达水平和miR-200c/141CpG岛的甲基化水平明显升高。 2.TGF-β诱导胃癌中miR-200c和miR-141表达降低。 3.胃癌中升高的miR-200c/141CpG岛的甲基化水平诱导miR-200c和miR-141表达降低。 4.地西他滨能够通过降低miR-200c/141CpG岛的甲基化水平促进miR-200c和miR-141的表达，并能够缓解TGF-β对miR-200c和miR-141的抑制作用。收起

关键词 : 胃癌病理机制非编码核糖核酸-200c 非编码核糖核酸-141

2. 血浆microRNA-208a、210、506与急性心肌梗死患者的相关性研究

[学位论文] 李胜男延边大学 2016年硕士导师: 李玉子共49页

摘要 : 目的: 检测急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者与健康人血浆microRNA-208a(miR-208a)、microRNA-210(miR-210)和microRNA-506(miR-506)的表达。探讨血浆miRNAs在AMI早期诊断的意义及其与AMI严重程度的相关性，同时对比其在延边... 展开目的: 检测急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者与健康人血浆microRNA-208a(miR-208a)、microRNA-210(miR-210)和microRNA-506(miR-506)的表达。探讨血浆miRNAs在AMI早期诊断的意义及其与AMI严重程度的相关性，同时对比其在延边地区朝鲜族与汉族AMI患者间的表达差异。方法: 本研究共纳入77名受试者。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescente quantitative Polymerase chain reaction, qRT-PCR)方法检测血浆miR-208a、miR-210、miR-506表达量。心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白(TroponinⅠ，cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(Creatine phosphokinase-isoenzyme-MB，CK-MB)含量通过全自动生化分析仪检测。最后对各检测结果及临床资料进行统计学分析。结果: AMI组miR-208a、miR-506相对表达水平较对照组升高(P＜0.01，P＜0.05)，miR-210相对表达水平较对照组降低（P＜0.01）。急诊手术组miR-208a相对表达水平较择期手术组升高(P＜0.05)。三种miRNAs相对表达水平在朝鲜族与汉族间无明显差异(P＞0.05)，在朝鲜族与汉族对照组间、朝鲜族与汉族AMI组间三种miRNAs相对表达水平也无差异(P＞0.05)。miR-208a相对表达量与年龄、CK-MB、cTnⅠ、pro-BNP呈显著正相关(r=0.254 P＜0.05,r=0.388 P＜0.01,r=0.495 P＜0.01,r=0.405 P＜0.01)。miR-210相对表达量与年龄、pro-BNP呈负相关（r=-0.252 P＜0.05，r=-0.292 P＜0.05）。miR-506相对表达量与LDL-C、CK-MB、cTnⅠ、pro-BNP呈正相关(r=0.230 P＜0.05,r=0.277 P＜0.05,r=0.331 P＜0.01,r=0.249 P＜0.01)。Gensini评分与miR-208a、miR-506呈显著正相关(r=0.682 P＜0.01，r=0.353 P＜0.01)，而与miR-210呈显著负相关(r=-0.416 P＜0.01)。MiR-208a曲线下面积0.917(95％CI0.856-0.979)，miR-210曲线下面积0.753(95％CI0.624-0.882)，miR-506曲线下面积0.807(95％CI0.699-0.915)，CK-MB曲线下面积0.758(95％CI0.653-0.864)，cTnⅠ曲线下面积0.750(95％CI0.644-0.856)。结论: 1.miR-208a可作为早期诊断AMI的生物标志物，其诊断效能并不优于CK-MB、cTnⅠ，miR-210、miR-506也可能是AMI的诊断标记物，但其早期诊断能力可能不及miR-208a; 2.miR-208a具有反应冠状动脉粥样硬化严重程度和危险分层的潜力; 3.AMI患者血浆miR-208a、miR-210、miR-506的表达水平无地区民族差异。收起

关键词 : 急性心肌梗死临床诊断非编码单链核糖核酸-208a 非编码单链核糖核酸-210 非编码单链核糖核酸-506

3. miR-215和miR-218在急性髓系白血病中的表达及其临床意义的研究

[学位论文] 王妍妍江苏大学 2015年硕士导师: 胡嘉波共64页

摘要 : 目的：本研究拟通过实时定量PCR(RQ-PCR)的方法，对急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia，AML)患者骨髓中的微小RNA-215(microRNA-215，miR-215)和微小RNA-218(microRNA-218，miR-218)的表达进行相关检测，并通过分析miR-215和miR-218在AML患... 展开目的：本研究拟通过实时定量PCR(RQ-PCR)的方法，对急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia，AML)患者骨髓中的微小RNA-215(microRNA-215，miR-215)和微小RNA-218(microRNA-218，miR-218)的表达进行相关检测，并通过分析miR-215和miR-218在AML患者和正常人骨髓单个核细胞中表达情况的差异对其临床意义进行探讨。方法： 1、研究对象:miR-215的检测中共收集70例AML患者骨髓标本，对照组为16例正常人骨髓标本。miR-218的检测中共收集71例AML患者骨髓标本，对照组为14例正常人骨髓标本。 2、设计与合成引物:参照相关文献，采用Premier Primer5软件进行miR-215和miR-218及内参U6基因的引物设计。 3、对各研究对象的骨髓单个核细胞进行分离，并对细胞中的总RNA进行提取，然后经逆转录过程将cDNA合成，进行RQ-PCR，对miR-215和miR-218的表达进行检测得到Ct值，分析测定△Ct值。△Ct值=目的基因Ct值-内参基因Ct值。 4、分别对miR-215和miR-218的测定结果与患者临床资料进行分析。 5、对所得到的实验数据进行相关统计学分析。结果： 1、总RNA纯度分析:通过紫外分光光度计对所提取的总RNA进行分析检测，结果显示大部分OD260/280的比值分布在1.8-2.2之间，纯度较高。 2、U6内参基因和目的基因经扩增后生成熔解曲线，曲线呈单一、锐利的峰表明扩增产物没有产生明显的引物二聚体，没有出现非特异性扩增现象，产物较均一。用2％浓度的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分析，观察扩增片段呈单一条带，说明没有非特异性扩增出现和引物二聚体产生。 3、AML患者中miR-215和miR-218的表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义(P均＜0.05)。 4、AML患者中miR-215表达与患者的年龄、性别、血红蛋白含量、PLT计数、FAB分组和核型分析之间无相关性(P＞0.05)，但与白细胞计数有关，低表达组的WBC计数明显高于高表达组(P＜0.05); miR-215低表达组患者的NPM1基因突变率高于高表达组患者(P=0.008)，其余9种基因突变无相关性。 5、AML患者中miR-218表达与患者的年龄、性别、WBC、Hb含量、PLT计数、FAB分组和核型分析、10种基因突变之间无相关性(P＞0.05)。 6、正常核型AML(CN-AML)患者中，miR-215低表达组患者总体生存时间明显低于高表达组(P=0.016); miR-218低表达组患者总体生存时间也明显低于高表达组(P=0.042)。结论： 1、miR-215和miR-218在AML患者中低表达是一个常见的分子事件。 2、miR-215和miR-218低表达CN-AML患者预后不良。收起

关键词 : 急性髓系白血病临床预后非编码核糖核酸-215 非编码核糖核酸-218 蛋白表达

4. miR-30b与miR-101调控肝癌细胞转移的作用机制研究

[学位论文] 赵曙华南京大学 2015年硕士导师: 臧宇辉共49页

摘要 : 上皮间质转化(EMT)是上皮细胞通过特定程序转化为间质表型细胞的生物学过程，EMT与肿瘤的侵袭与转移过程密切相关，是导致肿瘤转移发生的关键因素之一。E-cadherin表达下调是EMT发生的标志，也是EMT发生的主要诱因。Snail和ZEB家族蛋白是EMT过程中抑制... 展开

关键词 : 肝癌细胞转移非编码核糖核酸-30b 非编码核糖核酸-101 上皮间质转化

5. miR-378a-3p、miR-107和相关circRNA调控牛肌细胞发育的机制研究

[学位论文] 魏雪锋西北农林科技大学 2017年博士导师: 陈宏共114页

摘要 : 肌肉发育是影响产肉量及肉品质的重要因素之一，肌肉发育主要依赖于肌细胞增殖、分化。肌细胞增殖、分化过程涉及多基因的表达、信号传导及网络式调控，受到众多因素的调节。尽管肌肉发育的分子机制一直是发育生物学的重点研究对象，但至今为止仍然有... 展开肌肉发育是影响产肉量及肉品质的重要因素之一，肌肉发育主要依赖于肌细胞增殖、分化。肌细胞增殖、分化过程涉及多基因的表达、信号传导及网络式调控，受到众多因素的调节。尽管肌肉发育的分子机制一直是发育生物学的重点研究对象，但至今为止仍然有相当数量的肌发生调节因子有待鉴定。miRNA是组织当中存在的主要的小RNA，长度约为18～24nt的单链小分子RNA，由茎环结构的Drosha和Dicer两种核糖核酸酶Ⅲ蛋白加工而成。近年来研究发现miRNAs在肌肉发育中有重要的调控作用，且关于miRNA的研究主要集中在调控下游靶基因方面，对影响miRNA自身表达水平的因素研究较少，而关于牛肌肉发育中miRNA的研究更少，且调控机制仍不清楚。另有报道环状RNA可作为miRNA分子海绵调控miRNA发挥功能，但牛肌肉中是否存在circRNA，且功能如何还未见报道。因此，本研究以高通量测序为基础分析牛肌肉组织中miRNAs及circRNAs表达，通过超表达、干扰手段，利用实时荧光定量PCR、双荧光素酶基因报告系统、CCK-8、EdU法、流式细胞仪检测法等技术，研究了miRNAs、circRNAs在肌肉细胞增殖、分化中的作用机制，及circRNA与miRNA之间的调控关系，构建关于circRNA-miRNA-mRNA的调控网络，揭示牛肌肉发育调控机制，为秦川牛分子育种提供新的理论依据。主要研究结果如下: 1.miR-378a-3p通过靶基因HDAC4调控肌细胞增殖、分化及凋亡从前期秦川牛骨骼肌miRNAs高通量测序结果中鉴定发现miR-378a-3p在肌肉组织中的表达量显著高于其他组织，通过CCK-8、EdU及qRT-PCR等方法检测miR-378a-3p对肌细胞增殖的作用，结果显示超表达miR-378a-3p可显著降低肌细胞增殖系数及增殖标志基因cyclinD1表达量，表明肌细胞增殖受到抑制;同时，超表达miR-378a-3p能够下调细胞凋亡抑制因子BCL-2基因表达水平，上调凋亡诱导因子BAX和caspase-3基因表达水平，从而促进肌细胞凋亡。另外，超表达miR-378a-3p显著上调肌分化因子MyoD和MyHC基因mRNA和蛋白质表达水平，促进肌细胞分化、肌管产生。机制研究发现miR-378a-3p通过抑制靶基因HDAC4转录后翻译水平，从而抑制肌细胞增殖，促进肌细胞的分化和凋亡。 2.miR-107通过调控靶基因Wnt3a抑制牛肌细胞的增殖、分化 miR-107由牛26号染色体泛酸激酶1基因(PANK1)第7内含子转录而来，与人和小鼠序列高度保守，在肌肉组织中有较高的表达水平。超表达miR-107显著下调肌分化因子MyHC、MyoD和MyoG基因mRNA及蛋白质表达水平，抑制肌细胞分化;降低细胞增殖系数和增殖标志基因PCNA表达。同时，超表达miR-107调控肌细胞凋亡因子BCL-2、p53和caspase9基因mRNA表达和蛋白质翻译水平。由TargetScan软件预测并通过双荧光素酶报告系统证明Wnt3a基因是miR-107的一个直接靶基因。超表达miR-107显著降低Wnt3a基因mRNA和蛋白表达水平，而siRNA干扰Wnt3a基因，可显著抑制肌细胞分化、增殖及凋亡;这些结果表明miR-107可通抑制控靶基因Wnt3a的表达水平而调控肌细胞的分化、增殖和凋亡，可作为牛分子育种的另一分子标记。 3.秦川牛肌肉组织circRNAs的鉴定及筛选为研究秦川牛肌肉组织中是否存在与肌肉发育相关circRNA，本研究利用去除核糖体RNA高通量测序技术，鉴定秦川牛肌肉组织胚胎和成年牛肌肉中circRNAs表达情况，得到了12，981个候选circRNAs，其中2400个circRNAs在胚胎和成年期肌肉组织中同时存在。特征分析显示大多数circRNA转录长度不足2000核苷酸(nt)，平均长度为822nt，含2～7个外显子，远小于其相对的蛋白编码基因的转录本长度。circRNAs在所有染色上广泛分布，染色体越长，产生circRNA数目越多。不同时期表达差异分析，得到了828个差异表达的circRNAs，其中624个上调，204个下调，表明表达差异的circRNA可能在牛肌肉发育过程中发挥着重要作用。通过qRT-PCR分析了17个表达差异的circRNAs，结果与circRNA测序结果一致，表明测序结果的准确性，同时发现circRNA42在肌肉发育过程中下调程度最大，暗示其在肌肉发育中可能具有重要功能。 4.circLMO7通过吸附miR-378a-3p调控牛肌肉原代细胞增殖、分化及凋亡 circLMO7（circRNA42）来源于LMO7基因，全长2，312nt，包含9个外显子，在肌肉组织中表达量显著高于其他组织。经RNAhybrid软件预测发现circLMO7序列中有一个miR-378a-3p结合位点，双荧光素酶报告系统检测表明circLMO7与miR-378a-3p靶向结合，且超表达circLMO7(pcDNA-circLMO7)能显著降低miR-378a-3p表达量。利用CCK-8、EdU法及qRT-PCR等技术检测发现，circLMO7促进肌细胞增殖，上调增殖标志基因cyclinD1表达;同时circLMO7抑制肌细胞的凋亡，促进凋亡相关标志基因BCL-2在mRNA和蛋白水平的表达，抑制BAX和caspase9基因mRNA表达及蛋白翻译水平。另外，circLMO7显著下调肌肉分化标志基因MHC、MyoG和MyoD的表达水平，抑制肌细胞分化和肌管的产生。这些结果与超表达miR-378a-3p对细胞增殖、分化等的作用相反，同时circLMO7能增强miR-378a-3p靶基因HDAC4表达水平。综合以上结果表明circLMO7能够通过结合miR-378a-3p解除miR-378a-3p对靶基因HDAC4基因表达的抑制作用，进而调控肌细胞的增殖、分化及凋亡。本章研究揭示了circLMO7可能作为miR-378a-3p的上游调控因子，影响牛肌肉发育。本研究为揭示秦川牛肌肉发育分子调控机理积累了基础资料并提供了新的研究思路，同时为非编码RNA的机制研究增添了新的证据，也为我国良种肉牛的资源保护和分子育种提供了新的分子标记。收起

关键词 : 牛肌肉发育分子机制非编码核糖核酸-107 非编码核糖核酸-378a-3p

6. LncRNA NR_028505在肺癌发生发展中的作用及其与miR-22-3p的关系研究

[学位论文] 张绍珠广州医科大学 2015年硕士导师: 蒋义国;杨巧媛共76页

摘要 : 背景与目的：肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其发病率已位于男性各种恶性肿瘤的首位，而女性肺癌发病率已上升至第二位，且呈现逐渐上升态势。2014年中国肺癌发病率达到35.23/105，死亡率达27.93/105，位居恶性肿瘤发病率和死... 展开背景与目的：肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其发病率已位于男性各种恶性肿瘤的首位，而女性肺癌发病率已上升至第二位，且呈现逐渐上升态势。2014年中国肺癌发病率达到35.23/105，死亡率达27.93/105，位居恶性肿瘤发病率和死亡率榜首，在中国肺癌已取代乳腺癌成为女性恶性肿瘤头号杀手。目前肺癌的治疗手段仅局限于手术切除或常规放/化学治疗，肺癌患者的预后情况十分严峻，5年生存率只有约11%。另一方面，由于缺少早期诊断的依据，肺癌患者确诊时肿瘤细胞往往已发生了侵袭和转移，这是导致肺癌患者预后不良的重要因素。目前已有大量研究表明，基因表达与调控功能异常是肺癌发生发展的内因和基础，深入探讨肺癌发生的分子机制，寻找和确认新的早期诊断肺癌标记物，是肺癌预防和治疗领域的当务之急。在过去的几十年里，相关研究把注意力主要集中于编码基因在肿瘤中的发病机制，实际上，人类基因组中蛋白编码基因所占的比例不到2%，超过90%的基因被转录成为非编码RNA（ncRNA）。ncRNA按长度可划分为两类：短片段非编码RNA（miRNAs）和长片段非编码RNA(lncRNAs)。LncRNAs是一类长度>200nt的ncRNA，在癌症的发生发展中发挥重要作用。尽管大量lncRNAs已被发现，但lncRNAs的生物学功能还存在着巨大的未知。近两年报道显示，在肿瘤发展过程中miRNAs和lncRNAs均为关键的基因表达调控分子，约有1/2以上的miRNAs是从其他已知基因的内含子/外显子区域生成，这些miRNA被称为基因内miRNAs，它们与其宿主基因之间的相互调控作用，在肿瘤发生中扮演着十分重要的角色。研究表明基因内miRNAs可对宿主基因进行反馈调节，而有些宿主lncRNAs通过加工成为miRNA间接调控miRNA下游靶点。有研究报道，lncRNA NR_028505高表达与乳腺癌的低复发率相关，而miR-22在多种肿瘤中表达下降并与癌症预后相关，miR-22可直接或间接与癌基因结合，抑制其下游功能。LncRNA NR_028505是miR-22的宿主基因，其二者的表达有很强的关联性，在多种癌症中两者表现出共表达现象。本课题对lncRNA NR_028505在肺癌中的表达及其与临床意义进行探讨，并对lncRNA NR_028505进行功能性研究，揭示lncRNA NR_028505在肿瘤中可能发挥的作用，探索其与miR-22之间的相关性及相互调控关系。方法： 1.肺癌组织样本2012年12月至2014年12月期间，收集广州军区总医院胸外科行肺癌根治性或姑息性切除术的患者肺癌组织及配对癌旁正常组织（癌旁组织距离癌中心组织＞5cm）130例，患者均为原发性肺癌，均未进行术前化/放疗，同时收集患者个人信息和详细临床病理资料。 2.细胞系及培养方式人类正常肺支气管上皮细胞株（16HBE），5株人类肺癌上皮细胞（A549、H1299、H460、H446、95-D）使用MEM培养基（美国HyClone公司）或RPMI-1640完全培养基在37℃，5％CO2，饱和湿度的恒温培养箱中培养。 3.总RNA提取及qRT-PCR分析TRIzol法提取组织细胞总RNA，lncRNA检测采用荧光染料（SYBR GreenⅡ）法进行qRT-PCR检测，miR-22-3p采用TaqMan探针法进行qRT-PCR检测。7500荧光定量PCR仪上进行相对定量分析。 4.LncRNA NR_028505和miR-22-3p瞬时转染LncRNA NR_028505siRNA和miR-22-3p mimic/inhibitor均使用Lipofectamine-3000按转染说明书步骤对A549细胞进行转染，干扰效果采用qRT-PCR进行相对定量分析。 5.细胞周期检测适量细胞接种于6孔板，无抗生素培养基37℃，5％CO2培养24h后转染siRNA，24h后收集并用70%乙醇固定细胞，过夜，然后用PI染色，于流式细胞仪中检测细胞周期分布情况。 6.细胞凋亡检测适量细胞接种于6孔板，无抗生素培养基37℃，5％CO2培养24h后转染siRNA，24h后收集细胞，按Annexin V-FTIC/PI试剂盒步骤对细胞进行染色，立即在流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。 7.LncRNA NR_028505亚细胞定位按PARIS?Kit说明书进行细胞胞质胞核分离并提取RNA，用qRT-PCR检测lncRNA NR_028505和内参基因在胞质胞核中的相对表达量。结果： 1.LncRNA NR_028505在肺癌组织及细胞中的表达情况130例肺癌患者中96.9%（126/130）患者癌组织中lncRNA NR_028505表达水平低于其配对癌旁正常组织（P＜0.001）；与16HBE比较，lncRNA NR_028505在肺癌细胞株中基本呈现低表达（P＜0.05）。 2.lncRNA NR_028505表达水平与肺癌患者临床病理特征的相关性将126例低表达肺癌样本以中位数（M=0.0604）为标准分为两组进行比较分析，发现lncRNA NR_028505的低表达水平与肿瘤的分型、分化程度及淋巴结转移相关（P＜0.05）；运用logistics回归对上述相关因素进行分析，肿瘤分化与lncRNA NR_028505的表达相关（P=0.003），肿瘤分化程度越低，lncRNA NR_028505的表达水平越低（P＜0.05），排除分化影响后，淋巴结转移仍与lncRNA NR_028505的表达相关（P＜0.05），而肿瘤分型则与lncRNA NR_028505的表达不相关（P＞0.05）。 3.瞬时转染siRNA下调lncRNA NR_028505表达设计4对siRNA序列及1对negative control（siRNA-nc）序列转染A549细胞，siRNA-1和siRNA-350nmol/L转染24h对目的基因的干扰效果达90%以上，选为最佳转染序列和条件。 4.下调lncRNA NR_028505对细胞功能的影响下调lncRNA NR_028505表达后采用流式细胞仪对A549细胞进行细胞周期检测，结果显示siRNA-1和siRNA-3转染组S期细胞比例均明显增加，siRNA-1和siRNA-3组分别为（22.90%±0.75%）和（23.38%±1.15%），与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05)；细胞凋亡检测结果显示，与对照组比较，siRNA-1和siRNA-3转染组细胞凋亡率明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 5.miR-22-3p在肺癌组织及细胞中的表达情况实时荧光定量PCR技术检测miR-22-3p在肺癌组织样本中的表达情况。114例肺癌患者中有62.3%（71/114）肺癌患者中miR-22-3p在癌组织中的表达量低于癌旁组织，而癌组织中miR-22-3p表达高于癌旁组织仅占37.7%（43/114），差异有统计学意义（P<0.05）；与16HBE相比，肺癌细胞系A549、H1299和95-D中miR-22-3p呈现低表达（P<0.05），miR-22-3p在肺癌组织及细胞中的表达与其宿主基因lncRNA NR_028505的表达情况趋于一致。 6.LncRNA NR_028505与miR-22-3p的相互作用关系相关分析显示，肺癌组织中LncRNA NR_028505与miR-22-3p的表达呈正相关趋势（R2=0.066，P=0.038）；转染miR-22-3p mimic后，其宿主基因lncRNA NR_028505的表达明显受到抑制（p＜0.001），而转染miR-22-3p inhibitor抑制miR-22-3p表达后，lncRNA NR_028505的表达水平上升(p＜0.05)；干扰lncRNA NR_028505表达后，miR-22-3p的表达同时下降44%（P＜0.05）。结论： 1.LncRNA NR_028505在肺癌组织和肺癌细胞株中呈低表达，提示NR_028505可能在肺癌发生发展过程中发挥抑癌基因的作用。 2.LncRNA NR_028505表达水平与肺癌分化程度和淋巴结转移相关，lncRNA NR_028505表达水平越低，肺癌恶性程度越高，发生转移的可能性越大，提示LncRNA NR_028505可作为肺癌恶性程度评价和预后评价的指标。 3.下调lncRNA NR_028505表达可导致细胞周期改变，抑制细胞凋亡，提示lncRNA NR_028505可能通过促进细胞凋亡，改变细胞周期进程发挥抑癌基因作用。 4.miR-22-3p在肺癌组织和肺癌细胞株中呈低表达，表达水平与其宿主基因lncRNA NR_028505的表达水平呈正相关。 5.LncRNA NR_028505可能作为miR-22-3p的前体，以前体的形式直接影响miR-22-3p的生成与表达。 6.基因内miRNA miR-22-3p负向反馈调节宿主基因lncRNA NR_028505的表达。收起

关键词 : 肺癌发病机制长链非编码核糖核酸微小核糖核酸22-3p 非编码RNA 宿主基因

7. miR143、miR145对C2C12细胞分化的影响作用研究

[学位论文] 周新宇四川农业大学 2015年硕士导师: 朱砺共69页

摘要 : MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21nt的非编码小分子RNA，通过与靶基因3'-UTR区域结合从而对靶基因起抑制作用或对其直接降解。miRNA虽然数量很少，却参与了大量的生物学过程，例如细胞的生长与凋亡、癌细胞的增殖、组织与神经分化、细胞代谢、肌细胞和... 展开 MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21nt的非编码小分子RNA，通过与靶基因3'-UTR区域结合从而对靶基因起抑制作用或对其直接降解。miRNA虽然数量很少，却参与了大量的生物学过程，例如细胞的生长与凋亡、癌细胞的增殖、组织与神经分化、细胞代谢、肌细胞和脂肪细胞的分化等。骨骼肌作为动物机体上最大的组织，其发育是一个十分复杂的过程，除了受到许多成生肌调节因子的调节外，表观遗传因素也对骨骼肌的发育起着重要遗传调控作用，如miRNA对mRNA的转录后修饰。经典Wnt/β-catenin信号通路广泛参与对许多生物学过程的调控，包括癌细胞的发育、纤维化、成骨分化等等。近年来，越来越多的研究发现Wnt/β-catenin信号通路还参与调控骨骼肌的发育过程，并且对不同肌纤维类型的分化形成也具有调控作用。而Wnt信号通路在行使其生物学功能的过程中，同样会受到许多miRNA的调控。本实验以C2C12细胞为模型，通过miRNA mimic和inhibitor分别实现miR143和miR145的高表达和抑制，重点研究miR143和miR145通过Wnt/β-catenin信号通路影响C2C12细胞分化的生物学机制。主要结果如下: 1.在正常分化的C2C12细胞中，miR143和miR145表达量随着细胞分化过程的进行逐渐升高。 2.在C2C12细胞分化第4天之后，高表达与低表达miR143和miR145都会使MyoD和MyoG的表达量极显著降低(P＜0.01)。整个分化过程中miR143对Myf5的影响不显著(P＞0.05)，而过表达或低表达miR145都会使Myf5的表达水平极显著升高(P＜0.01)。在细胞分化中期（第4天到第6天），MRF4会受到过表达miR143和miR145的影响，而低表达miR143和miR145对MRF4的影响不显著（P＞0.05）。过表达miR143和miR145会抑制成肌分化的标志基因MyHC和ACTA1的表达，而低表达miR145时会显著抑制MyHC的表达(P＜0.01)。以上结果表明miR143和miR145参与对C2C12细胞分化过程的调控作用，但调控调控的作用存在差异。 3.miR143能显著抑制4种肌纤维类型的表达，而且主要作用于Ⅱ型肌纤维。在细胞分化末期miR145不论高表达还是低表达都会显著抑制4种肌纤维的表达水平。以上结果表明miR143会抑制肌细胞分化过程的肌纤维类型分化，而过表达与低表达miR145主要抑制MyHCⅠ和MyHCⅡa的表达水平。 4.miR143和miR145对经典Wnt/β-catenin信号通路的调控主要在细胞分化中期（第2到第6天），过表达与低表达miR143和miR145都会极显著提高通路主要信号基因Axin2、LRP5和β-catenin的表达水平(P＜0.01)，但两个miRNA的调控作用有差异性。非经典Wnt信号通路的激活蛋白Wnt5a在过表达miR143和miR145时，其表达量都下降了，说明miR143和miR145不能通过非经典Wnt调控成肌分化。以上结果表明在C2C12细胞分化过程中，miR143和miR145对细胞分化早期调节因子有促进作用，但不能在细胞分化末期促进细胞分化后期调节因子的表达，而且会抑制成肌标志基因的表达。本研究还表明miR143和miR145会抑制肌纤维类型的分化，但能在细胞分化中期促进经典Wnt通路蛋白LRP5、Axin2、和β-catenin的表达。转染实验中miR143和miR145并未如期作用促进成肌分化，所以miR143和miR145对C2C12细胞分化的影响、miR143和miR145与Wnt信号通路之间相互作用的交互效应等还需要进一步深入的研究。收起

关键词 : 成肌细胞12 细胞分化非编码小分子核糖核酸143 非编码小分子核糖核酸145

8. 慢病毒载体(miRNA Sponge)介导miR-17、miR-20a基因沉默的抗白血病作用机制研究

[学位论文] 牛文艳福建医科大学 2014年硕士导师: 战榕共112页

摘要 : 目的：构建miR-20a基因的miRNA Sponge载体，建立Jurkat-S稳定细胞株，为进一步研究miR-20a功能及应用干扰技术治疗奠定基础；检测急性白血病患者中miR-17、miR-20a前体的表达情况并探讨miRNA Sponge介导的miR-17、miR-20a沉默的抗白血病作用机制。 ... 展开目的：构建miR-20a基因的miRNA Sponge载体，建立Jurkat-S稳定细胞株，为进一步研究miR-20a功能及应用干扰技术治疗奠定基础；检测急性白血病患者中miR-17、miR-20a前体的表达情况并探讨miRNA Sponge介导的miR-17、miR-20a沉默的抗白血病作用机制。方法：设计、合成一对含有2个重复针对miR-20a成熟序列第9-12碱基错配的序列，并带有酶切位点，退火后连接到pCDNA3.0-L表达载体上；载体双酶切后再与退火产物连接，重复4次，酶切及荧光素酶活性鉴定；亚克隆到慢病毒表达载体，与psPAX2、PMD2G共转染HEK293T细胞，包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度，感染高表达miR-17、miR-20a的Jurkat细胞株；应用real-time PCR和Western blot技术分别检测Jurkat-S稳定细胞中P21及E2F1 mRNA和蛋白水平的表达，并与对照组进行比较；CCK-8方法及流式细胞仪方法分别检测miR-17、miR-20a沉默对Jurkat细胞增殖能力及细胞周期的影响。采用real-time PCR方法检测初治急性白血病患者及白血病细胞株中miR-17、miR-20a前体的表达水平，分析其在各型白血病中的表达情况。结果:成功构建针对miR-20a基因的Sponge载体，病毒滴度为5×107TU/ml；建立稳定转染的Jurkat-S细胞株，有效干扰验证显示miR-20a Sponge能明显上调P21及E2F1的mRNA及蛋白水平，差异有统计学意义(p<0.05)；初治急性白血病患者中miR-17、miR-20a前体的表达明显高于正常对照(p<0.05)；且与急性髓系白血病患者相比，急性淋巴细胞白血病患者中的表达量更高；然而二者表达量与患者外周血白细胞水平无明显相关性(p>0.05)；miR-17、miR-20a沉默能抑制Jurkat细胞的增殖，且导致细胞周期阻滞于G1-S期。结论：成功构建miR-20a基因的miRNA Sponge载体，建立稳定干扰miR-20a表达的Jurkat-S细胞株。急性白血病患者中miR-17、miR-20a呈过表达，可能参与白血病的发生、发展；高表达的miR-17、miR-20a可通过在转录后抑制P21、E2F1表达,从而促进细胞增殖及细胞周期G1-S期转换。收起

关键词 : 非编码核糖核酸-17基因非编码核糖核酸-20a基因慢病毒载体抗白血病作用

9. MiRNA137和miRNA29a在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

[学位论文] 赵明南京大学 2012年硕士导师: 宋勇共47页

摘要 : 目的:在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者中，研究miRNA-137和miRNA-29a两者的表达水平在肺癌组织标本和癌旁正常组织标本中有何差异，观察这种差异性表达与临床资料之间的关系，并探讨这两种因子在NSCLC患者中的表达与诊断及预后... 展开

关键词 : 非小细胞肺癌非编码核糖核酸-137基因非编码核糖核酸-29a基因病理机制

10. 玉米赤霉素响应的编码RNA和长链非编码RNA研究

[学位论文] 赵佳扬州大学 2019年硕士导师: 王益军共82页

摘要 : 植物激素赤霉素调控种子萌发、株型建成、花器官发育等众多生物学过程。第一次“绿色革命”选育的半矮秆品种，其矮生性状归应于赤霉素合成与信号通路的改变。因此，围绕植物激素赤霉素开展相关研究，具有重要的理论与应用意义。赤霉素响应的编码RNA和... 展开植物激素赤霉素调控种子萌发、株型建成、花器官发育等众多生物学过程。第一次“绿色革命”选育的半矮秆品种，其矮生性状归应于赤霉素合成与信号通路的改变。因此，围绕植物激素赤霉素开展相关研究，具有重要的理论与应用意义。赤霉素响应的编码RNA和长链非编码RNA的研究已经在甜瓜、葡萄、杨树等植物中开展，但对于玉米等重要禾谷类作物赤霉素编码RNA和长链非编码RNA的研究报道较少。基于此，本文开展了玉米赤霉素响应的编码RNA和长链非编码RNA研究。本研究以核背景为Mo17的高世代回交群体(BC5)中的株高正常植株(记为野生型WT)和矮秆植株（记为D11）为实验材料。用水（作为对照）、不同浓度赤霉素GA3溶液(10-4 M、10-5 M、10-6 M)处理WT、D11。结果表明，与水处理相比，不同浓度赤霉素处理的WT、D11的第2叶鞘长均显著增加。根据赤霉素处理的结果，本研究取样水处理、10-4 M GA3处理的WT、D11的第2叶鞘，构建链特异性去核糖体文库，进行高通量测序，发掘玉米赤霉素响应的编码RNA和长链非编码RNA，并开展相关功能研究工作。 1、赤霉素响应的编码RNA:与水处理相比，赤霉素处理的WT中有390个基因差异表达，其中271个上调、119个下调。差异表达的基因与囊泡转运、次生代谢产物生物合成等相关。与水处理相比，赤霉素处理的D11中有6995个基因差异表达，其中2686上调、4309个下调。差异表达的基因与质体、次生代谢产物生物合成等相关。在差异表达的基因中，存在11个赤霉素通路相关的基因，包括1个编码CPS酶的基因、2个编码KS酶的基因、1个编码KO酶的基因、4个编码GA2ox酶的基因、1个编码赤霉素受体GID1的基因、2个编码赤霉素信号负向调节因子DELLA的基因。WT、D11共同检测到的差异表达基因有213个，其中一致上调的有38个，一致下调的有56个。共表达分析表明，213个差异表达的基因构成了复杂的调控网络。 2、赤霉素响应的长链非编码RNA: WT水处理、WT赤霉素处理、D11水处理、D11赤霉素处理中分别发掘到10247、9948、10444、8359个lncRNA。其中，超过88％的lncRNA属于基因间lncRNA，约9％的lncRNA是由反义链转录产生，剩下的lncRNA为正义链转录产生。与水处理相比，赤霉素处理的WT中有21个lncRNA差异表达，其中11个上调、10个下调。差异表达lncRNA的顺式靶基因有14个。与水处理相比，赤霉素处理的D11中有428个lncRNA差异表达，其中172个上调、256个下调。差异表达lncRNA的反式靶基因有13个、顺式靶基因有206个（111个位于lncRNA上游、95个位于lncRNA下游）。其中一个靶基因编码赤霉素代谢的酶GA2ox6，该靶基因对应的lncRNA为TCONS_00031061，LncRNA TCONS_00031061和靶基因GA2ox6均位于玉米第6染色体，相距208bp。WT、D11共同检测到的差异表达lncRNA有4个，分别为TCONS_00107636、TCONS_00025659、TCONS_00044580、TCONS_00064738。其中，长度为2809 bpTCONS_00025659的序列与B73参考基因组序列完全一致，未发现任何序列变异。通过RT-PCR结合序列测定，对TCONS_00025659的可靠性进行了验证。在TCONS_00025659上游1.5 kb处，存在3个赤霉素响应原件。TCONS_000256599在玉米根、叶片、叶鞘、籽粒中均表达。根据TCONS_000256599序列设计特异性DNA探针，进行原位杂交。在根尖细胞中，可以检测到绿色荧光信号。进行DAPI细胞核染色实验，亦为后续TCONS_00025659定位提供参考。TCONS_00025659序列与玉米Gypsy/DIRS1类逆转座子序列具有较高相似性，lncRNA TCONS_00025659可能来源于玉米逆转座子。本研究所得结果不仅有助于丰富对赤霉素调控网络的认识，也可以为后续的研究工作提供可能的赤霉素响应编码RNA和长链非编码RNA靶点。收起

关键词 : 玉米赤霉素响应机理编码核糖核酸长链非编码核糖核酸