中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 栗召辉昆明医学院 2008年硕士导师: 王秦秦共47页

摘要 : 目的：鉴定抗云锡矿工肺鳞癌单克隆抗体(C6)的特异性、纯化其抗体，为进一步获取YTMLC-90(云锡矿工肺鳞癌)肿瘤抗原蛋白及肿瘤抗原基因、探索其发生机制奠定基础。方法：采用免疫印迹(Western blot)，检测各种肿瘤细胞、人正常细胞和各种肿瘤组... 展开

关键词 : 单克隆抗体肺癌纯化单克隆抗体交叉反应

2. 抗人DR5单克隆抗体的制备及抗肿瘤作用

[学位论文] 王婧河南大学 2008年硕士导师: 李淑莲;马远方共70页

摘要 : 背景：TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducingligand)是属于能够诱导细胞凋亡的TNF超家族成员。作为二型跨膜蛋白，它能够引起包括肿瘤细胞及一些转化细胞的凋亡。而DR5是TRAIL的重要受体之一，在TRAIL诱导细胞凋亡中起着重要的作用。DR5或DR4特异性的... 展开背景：TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducingligand)是属于能够诱导细胞凋亡的TNF超家族成员。作为二型跨膜蛋白，它能够引起包括肿瘤细胞及一些转化细胞的凋亡。而DR5是TRAIL的重要受体之一，在TRAIL诱导细胞凋亡中起着重要的作用。DR5或DR4特异性的抗体的作用将优于外源性TRAIL的应用，因为一些肿瘤细胞的表面不仅有DR5/DR4，而且还有诱骗受体的表达，使TRAIL的作用发挥受到限制，但是特异性的DR5抗体不会影响它的凋亡诱导作用。针对能够特异的通过和死亡受体结合而向下传递凋亡信号，引起靶细胞的凋亡的特点，DR5抗体克服了TRAIL的不良作用，成为理想的候选者。尽管国内外已经制备出一些DR5的抗体，其中有一种抗体已经进入临床一期的实验阶段，但是，至今仍没有上市的有效药物。目的：对已获得的小鼠抗人DR5单克隆抗体的特异性、抗体亚型以及生物学功能进行鉴定，并对抗体通过DR5进一步诱导肿瘤细胞凋亡的机制进行探讨。方法：将表达载体pET30a/DR5转化到BL21，经0.1mMIPTG诱导表达，镍柱纯化后，经SDS-PAGE、Western--blot和蛋白质谱分析鉴定抗原蛋白。以表达纯化的DR5抗原蛋白免疫Balb/c小鼠，经融合、筛选及反复克隆化为基础(抗体制备过程由天广实生物技术有限公司完成)，对获得的抗人DR5单抗-WD1进行鉴定，WesternBlot和FACS方法检测单抗WD1与重组的DR5及膜型DR5的结合。MTT法检测WD1对几种细胞的生长抑制作用。吉姆萨染色、Annexinv/PI双染检测WD1对Jurkat的凋亡作用。通过将pcDNA3.1/DR4重组质粒转染至293T细胞以FACS检测WD1与DR4的交叉反应性。通过RT-PCR的方法钓取Jurkat和Daudi细胞的DR5胞内段蛋白序列分析细胞的突变情况，做DISC免疫沉淀实验分析抗体与DR5激活的关系。结果：原核表达载体在BL21中实现大量表达，经SDS--PAGE和蛋白质谱分析鉴定，在19kD处有一明显的诱导表达带，其分子量大小与预期相符。Western-blot分析表明，该表达蛋白带可被抗人DR5抗体特异性的识别。为单抗的鉴定奠定了基础。成功制备了一株活性较好的抗DR5单克隆抗体-WD1。亚型分析WD1的重链为IgG1型，轻链为K型。WD1可识别19KD的DR5单体蛋白，而且也识别37KD的DR5二聚体蛋白。FACS分析结果提示WDl可与多种细胞的膜型DR5分子特异性结合，而与DR4收起

关键词 : 单克隆抗体制备

3. 1.抗人IgG-抗HRP双特异性单克隆抗体的研制;2.抗人IgG-抗HRP双特异性单克隆抗体在检测丙型肝炎病毒抗体中初步应用

[学位论文] 汪厚平卫生部武汉生物制品研究所 1996年硕士导师: 巫山共54页

关键词 : 单克隆抗体抗原制备

4. 抗组织型纤溶酶原激活物单克隆抗体的制备及其特性鉴定和初步应用

[学位论文] 张敏中国科学技术大学 2002年硕士导师: 翁屹;刘兢共53页

摘要 : 该实验室采用常规方法研制tPA的单克隆抗体：用重组tPA免疫Balb/c小鼠五次,取脾细胞与S/P20细胞融合,用ELISA方法筛选阳性克隆,用有限稀释法筛选单克隆细胞株,获得2株能稳定分泌抗tPA抗体的单克隆细胞株,1A3和1B3.并分别对其进行特性鉴定,如染色体核型... 展开

关键词 : 纤溶酶单克隆抗体

5. 抗粘附分子单克隆抗体对犬弓首线虫感染小鼠的嗜酸细胞影响的初步观察

[学位论文] 王朝霞河北医科大学 1997年硕士导师: 孟宪钦;焦炳忠共28页

关键词 : 分子单克隆抗体细胞

6. 伪狂犬病毒UL31蛋白单克隆抗体制备

[学位论文] 王鲁方河南农业大学 2023年硕士导师: 刘忠虎共55页

摘要 : 猪伪狂犬病毒病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)引起的猪急性传染病；PRV对各个年龄阶段的猪均可感染，发病猪的主要表现有发热、厌食、呼吸道症状、皮肤奇痒、妊娠母猪繁殖障和仔猪角弓反张等现象。并且PRV感染宿主范围广泛... 展开猪伪狂犬病毒病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)引起的猪急性传染病；PRV对各个年龄阶段的猪均可感染，发病猪的主要表现有发热、厌食、呼吸道症状、皮肤奇痒、妊娠母猪繁殖障和仔猪角弓反张等现象。并且PRV感染宿主范围广泛，例如牛、羊、野猪、狐狸、浣熊、犬类、家兔、啮齿动物等，并且有报道发现人感染PRV的病例，PRV具有跨物种传播并感染人类的风险，我国已将伪狂犬病列为二类动物疫病，因此PRV致病机制还有待进一步深入研究。在伪狂犬病毒研究过程中发现UL31蛋白与UL34蛋白互作形成复合物定位于细胞核核膜，对PRV完成复制后出核起重要的作用；但目前为止U31蛋白在其中的作用机制尚未完全明确，因此展开了UL31蛋白单克隆抗体的研究，为UL31蛋白的研究奠定基础。为了制备PRVUL31蛋白的单克隆抗体，本研究首先利用原核表达系统制备了 His-UL31重组蛋白，将纯化的His-UL31重组蛋白进行Westernblot鉴定，His-UL31重组蛋白均能与His单克隆抗体特异性结合。用His-UL31蛋白作为包被抗原，包被浓度为8μg/mL，PRV感染的猪血清稀释度达到1:25600仍可检测，建立了可特异性检测UL31抗体的间接ELISA方法。将His-UL31作为抗原来免疫12周龄雌性BALB/c小鼠，经3次免疫后取小鼠脾脏分离脾细胞并与SP2/0细胞进行融合。经4次间接ELISA方法筛选后，获得1株能稳定分泌抗UL31蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为UL315-11。对SP2/0细胞的染色体数目和UL315-11单克隆细胞进行计数，SP2/0细胞的染色体数目平均约为65条，UL315-11单克隆细胞染色体数目平均约为110条，是两亲本染色体数目之和。取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定，确定该抗体亚型为IgM。将单克隆细胞以每只小鼠5×106个的数量进行腹腔注射，最终获得大批量带有UL315-11抗体的腹水，利用辛酸-低温乙醇沉淀法获得纯化腹水，得到MAb5-11，最后通过间接ELISA方法检测单克隆抗体效价为1:5120。通过间接免疫荧光试验、蛋白印迹分析和免疫组化试验验证MAb5-11具有良好的特异性和反应原性。本研究成功制备了PRVUL31的单克隆抗体，为进一步研究UL31蛋白的功能与结构奠定了基础。收起

关键词 : 伪狂犬病毒 UL31蛋白单克隆抗体单克隆抗体鉴定

7. 人肝素酶重组蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

[学位论文] 师红磊第三军医大学 2010年硕士导师: 杨仕明共88页

摘要 : 研究背景和目的恶性肿瘤是当前严重影响人类健康的最重要的疾病之一。而肿瘤的侵袭和转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤的转移过程非常复杂,目前认为转移性癌细胞侵袭转移主要通过以下三个步骤:1.肿瘤细胞通过细胞表面受体和细胞基质成分... 展开研究背景和目的恶性肿瘤是当前严重影响人类健康的最重要的疾病之一。而肿瘤的侵袭和转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤的转移过程非常复杂,目前认为转移性癌细胞侵袭转移主要通过以下三个步骤:1.肿瘤细胞通过细胞表面受体和细胞基质成分的粘附蛋白首先发生特异性结合,2.细胞外基质的水解酶降解过程,3.降解区发生瘤细胞的移动与侵袭。其中参与细胞外基质(ECM)降解过程中起作用的因素备受重视。肝素酶是1999年由四个不同的实验室克隆成功的一种肿瘤转移相关基因,肝素酶(heparanase,Hpa)是唯一能裂解ECM内蛋白多糖主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)的内源性糖苷内切酶。研究表明肝素酶可以通过降解HSPG途径破坏ECM、BM的完整性以及促进肿瘤新生血管的生成而促进肿瘤的转移。越来越多的研究证实,肝素酶在几乎所有的中晚期恶性肿瘤中都高表达,与肿瘤患者的不良预后密切相关,抑制肝素酶的表达可以明显减少肿瘤的侵袭和转移。因此,肝素酶有可能作为肿瘤诊断与治疗的新靶点。单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb)是单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。抗体主要由B淋巴细胞合成,每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。当机体受抗原刺激时,抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙,即克隆。如果选出一个合成一种抗体的细胞进行培养,就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群,即单克隆。单克隆细胞所合成的抗体即为单克隆抗体。1975年Kohler和Milstein首先报道,用细胞杂交技术,使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞融合,创建了第一个B细胞杂交瘤细胞株,获得了抗SRBC的单克隆抗体。这是免疫学,乃至医学史上的一个里程碑。单克隆抗体的特点是:理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制,并且来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视,并成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。单克隆抗体具有高度特异性、高纯度特点,使其在很大浓度范围内获得低背景,所以在组织免疫染色中特别有用,还可以应用于免疫沉淀,免疫印迹技术,并且都具有特异性高,背景低的优点。另外单抗还可以用来进行免疫亲和纯化抗原;对单克隆抗体进行标记还可以用做快速诊断以及疫苗的研究等。目前有关肝素酶的单克隆抗体多见于国外公司生产,我国尚无商品化的肝素酶单克隆抗体。单纯的从国外进口该抗体,价格昂贵,成本高。基于以上认识,本研究拟构建人肝素酶高效表达基因,以获得人肝素酶重组蛋白,再利用获得的高纯度肝素酶蛋白作为免疫原,采用常规免疫程序和杂交瘤技术筛选人肝素酶特异性单克隆抗体,并利用免疫组化、ELISA及Western Blot等技术对获得的人肝素酶单克隆抗体进行鉴定,最后获得人肝素酶特异性的单克隆抗体,为以后肝素酶单克隆抗体在临床诊断以及抗体介导的肿瘤靶向治疗提供实验依据。方法 1.将人肝素酶全长cDNA克隆到pET30a质粒,进一步转化入宿主菌BL21(DE3)中进行原核表达,采用Ni2+柱纯化对人肝素酶重组蛋白进行纯化,对表达的人肝素酶重组蛋白进行质谱分析; 2.将获得的肝素酶蛋白作为免疫源免疫Balb/c小鼠获得经免疫后能产生肝素酶抗体的B淋巴细胞:采用杂交瘤技术制备分泌肝素酶抗体的杂交瘤细胞株;采用有限稀释法筛选分泌抗体呈强阳性的克隆,并对上清液进行ELISA检测,鉴定筛选出的阳性克隆; 3.采用HIS亲和层析以及复性纯化技术纯化肝素酶单克隆抗体;获得的抗体采用Western Blot技术、免疫组化技术及ELISA技术检测制备的肝素酶单克隆抗体的特异性和抗体的效价。结果 1.我们采用PCR技术克隆了人肝素酶蛋白编码基因。经测序与GENBANK提供的基因序列完全一致。将克隆的人肝素酶基因序列克隆入原核表达质粒pET30a构建人肝素酶原核表达重组质粒;经1.0mmol/L IPTG37℃诱导表达5h,pET30a-Hpa在BL21中表达融合蛋白,分子量为63KD左右,表达量占菌体总蛋白的30%以上。经鉴定表达蛋白破菌后主要在沉淀中,为包涵体表达。采用HIS亲和层析及复性纯化方法,纯化获得人肝素酶重组蛋白; 2.利用纯化的人肝素酶蛋白免疫原采用常规免疫程序和杂交瘤技术,经细胞融合,筛选出15株抗人肝素酶的特异性单克隆抗体,经亚类鉴定其中有3株为适合应用于诊断试剂的IgG1; 3.经免疫组化、ELISA、及Western等多种手段对获得的肝素酶单克隆抗体进行特异性分析和效价鉴定,结果显示所制备的3株单抗为人肝素酶特异的,且效价较高的单克隆抗体。结论 1.我们采用PCR技术克隆了人肝素酶蛋白编码基因。获得了高纯度的人肝素酶蛋白,获得的肝素酶蛋白经鉴定其测定分子量与理论分子量相符,可以用于肝素酶单克隆抗体的制备; 2.成功制备了3株人肝素酶特异性的单克隆抗体,获得的三株人肝素酶单克隆抗体经ELISA、Western Blot和免疫组化等技术检测,证实其特异性高,并具有较高的效价,该研究结果提示我们制备的肝素酶单克隆抗体可能用于以肝素酶为靶点的肿瘤的诊断和治疗。收起

关键词 : 肿瘤肝素酶单克隆抗体

8. 抗人MMP24催化区单克隆抗体的制备及CE-SELEX平台的初步建立

[学位论文] 徐凯彪扬州大学 2008年硕士导师: 王宗元;曾令文共77页

摘要 : 基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)产生于正常组织细胞(包括成纤维细胞、结缔组织细胞、内皮细胞等)和肿瘤细胞，以前酶形式分泌，于细胞外间隙激活后而具有降解细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的蛋白水解酶活性。由于MMOs在ECM的... 展开基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)产生于正常组织细胞(包括成纤维细胞、结缔组织细胞、内皮细胞等)和肿瘤细胞，以前酶形式分泌，于细胞外间隙激活后而具有降解细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的蛋白水解酶活性。由于MMOs在ECM的破坏与降解过程中的重要作用，使其在组织损伤修复、细胞调亡、骨改建、胚胎发育、血管生成等生理过程和许多病理过程如多样硬化、狼疮、风湿、牙周疾病、肾小球肾炎、动脉粥样硬化、组织溃疡，特别是癌细胞侵袭与转移等方面发挥着十分重要的作用。MMP24又称膜型基质金属蛋白酶5(membrane-typematrixmetalloproteinase5，MT5-MMP)是新近发现的MMPs中的一员，其主要在脑中表达，另外在肾、胰腺和肺中也有一定的表达，MMP24在脑瘤、肾病等的发生发展机制及其诊断、治疗等方面具有重要作用。因其功能发挥关键在于MMP24的酶活性区域，即催化区(eatalyticdomain)，本研究正是针对MMP24催化区进行开展的。本研究通过体外表达获得了MMP24催化区重组蛋白(rMMP24-CD)，制备了针对该蛋白的高亲和力和特异性的单克隆抗体，旨在为MMP24的功能研究和脑瘤、肾病等的发生发展机制研究及其诊断、治疗、预后评价等提供有力的工具。同时，以其为靶标，进行了特异性核酸适体(aptamer)筛选的摸索，初步建立了该蛋白的CE-SELEX技术平台，为进一步开发抗体替代物核酸适体奠定基础。将含MMP24催化区基因的pET-15b．MMP24-CD载体转化GM感受态细胞，然后经IPTG诱导表达获得MMP24催化区重组蛋白(rMMP24-CD)，采用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化该蛋白，最终得到可溶性MMP24催化区重组蛋白，纯度80％以上，浓度0.6mg/mL。以重组蛋白rMMP24-CD免疫BALB/c小鼠，应用单克隆抗体制备技术筛选获得10株可分泌针对rMMP-CD的抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3A10、3C1、986、9C4、9C8、9F5、9Gll、9Hll、6E4、984。运用3A10、986和9Gll三株细胞免疫小鼠制得3种腹水，效价分别为1:2.5x106，1:1.3x106，1；6.4×105。WesternBlot实验表明，三种腹水特异性良好，且以3A10最好。SPR实验初步分析三种腹水的亲和性，结果表明三种腹水均可与rMMP24-CD结合，但3A10结合快，解离慢，亲和力高；986结合快，解离较快，亲和力中等；9H11结合较慢，解离最快，亲和力差。核酸适体作为一种新的具有抗体性质的核酸，在亲和力上与抗体相当，在特异性上可以达到识别一个甲基的水平，在稳定性、重复性、靶物质范围、筛选方法等方面都优于传统的抗体。本研究以rMMP24-CD为靶蛋白，设计合成了大小为78个碱基的ssDNA文库(含40个碱基的中间随机区)，采用高效毛细管电泳技术对其核酸适体(aptamer)筛选技术和平台建立进行了一定的摸索。通过研究，摸索建立了靶蛋白．核酸混合反应物的毛细管电泳分离条件和馏分收集方法，以及PCR扩增条件、次级文库制备方法。经过两轮筛选后，CE-LIF亲和实验结果表明，针对rMMP24-CD的特异性核酸适体得到了富集，初步建立了CE-SELEX技术平台。收起

关键词 : 催化单克隆抗体制备平台

9. 靶向Neuropilin-2单克隆抗体抗胃癌作用及其机制的研究

[学位论文] 周志连福建医科大学 2017年硕士导师: 陈玉强共71页

摘要 : 研究背景和目的：胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，在我国消化系统恶性肿瘤的发病率和死亡率居于首位，早期胃癌的首选手术治疗；但多数胃癌患者首诊时已为晚期，联合化疗方法毒副作用很大，疗效并不令人满意，很多患者对化疗药不能耐受。随着生... 展开研究背景和目的：胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，在我国消化系统恶性肿瘤的发病率和死亡率居于首位，早期胃癌的首选手术治疗；但多数胃癌患者首诊时已为晚期，联合化疗方法毒副作用很大，疗效并不令人满意，很多患者对化疗药不能耐受。随着生物医学的发展，分子靶向治疗在治疗晚期肿瘤中占据了非常重要的地位，目前多种分子靶向药物已经广泛地应用于临床晚期肿瘤的治疗中，主要针对EGFR、HER-2、VEGF、m-TOR等为靶点的治疗，分子靶向药物提高了抗癌治疗的特异性，明显降低了化疗药物的毒副作用，提高患者的耐受性，如西妥株单抗和曲妥株单抗，在临床上表现出很好的抗肿瘤作用。研究表明，神经纤毛蛋白2(Neuropilin-2,NRP-2)是一种单链跨膜糖蛋白，作为VEGF的协同受体， NRP2广泛表达于肿瘤细胞中，在肿瘤血管形成、肿瘤的发生发展、肿瘤的增殖、凋亡、迁移和粘附中形成重要的作用。目前对NRP-2的研究不是很多，有研究已证实在结直肠癌中高表达并对结直肠癌的发生、发展发挥了重要的作用，但与胃癌相关的研究很少，本文主要以自制NRP-2单克隆抗体，体外检测NRP-2单克隆抗体对胃癌细胞生长的影响及其机制的研究，为发展针对NRP-2为新型靶点奠定基础。实验方法：我们通过自制NRP-2单克隆抗体（NRP-2mAb），SDS-PAGE蛋白电泳法分析纯化后抗体的浓度和纯度，间接ELISA鉴定其效价。利用Western blotting和PCR实验方法检测三株不同胃癌NRP-2蛋白的表达，根据表达结果选择高表达的细胞株进行抗肿瘤作用及其机制的初步研究；流式细胞术检测抗体亲和力、细胞免疫荧光检测NRP-2mAb表达及其特异性；免疫组织化学染色检测NRP-2蛋白在胃癌病人组织和癌旁组织中的表达高低；CCK8比色法检测 NRP-2mAb对胃癌细胞的生长增殖影响，光镜下观察NRP-2mAb作用后胃癌细胞形态的改变；流式细胞术检测NRP-2mAb对细胞凋亡的影响；Transwell检测NRP-2mAb作用于胃癌细胞后对其迁移、侵袭作用的改变。Western blotting检测NRP-2mAb能调整相关增殖信号蛋白和相关凋亡信号蛋白，抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。实验结果：结果证明，BGC-823、SGC7901、MKN-28胃癌细胞膜上均有NRP-2抗原的阳性表达，均定位在细胞膜上，且BGC-823表达较高； NRP-2蛋白在胃癌病人中胃癌组织的阳性率比癌旁组织高，淋巴结转移、肿瘤大小、TNM分期、浸润深度及远处转移因素能显著影响NRP2的表达，而与性别、年龄、病理分级和病理形态相关性不明显；NRP-2mAb作用于胃癌细胞BGC-823抑制细胞的生长和增殖，且在某范围内，增加NRP-2mAb抗体浓度，对胃癌细胞 BGC-823的生长抑制作用增强；NRP-2mAb能促进胃癌细胞BGC-823的凋亡、抑制胃癌细胞BGC-823的迁移及侵袭；NRP-2 mAb通过下调相关增殖信号蛋白和抗凋亡信号蛋白的表达，上调相关促凋亡信号蛋白的表达，从而抑制细胞生长和促进细胞凋亡。结论： 1、本实验成功制备了高纯度、高特异性和亲和力强的NRP-2mAb。 2、NRP-2mAb能与胃癌细胞株及胃癌组织上NRP-2蛋白特异性结合，并定位于细胞膜上。 3、NRP-2mAb对胃癌细胞株的增殖、凋亡、迁移和侵袭有效抑制。 4、NRP-2mAb抑制胃癌细胞株的生长与抑制PI3K/AKT、MEK/ERK1/2信号通路相关。收起

关键词 : 胃癌靶向治疗单克隆抗体