摘要: 猪伪狂犬病毒病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)引起的猪急性传染病；PRV对各个年龄阶段的猪均可感染，发病猪的主要表现有发热、厌食、呼吸道症状、皮肤奇痒、妊娠母猪繁殖障和仔猪角弓反张等现象。并且PRV感染宿主范围广泛... 展开 猪伪狂犬病毒病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)引起的猪急性传染病；PRV对各个年龄阶段的猪均可感染，发病猪的主要表现有发热、厌食、呼吸道症状、皮肤奇痒、妊娠母猪繁殖障和仔猪角弓反张等现象。并且PRV感染宿主范围广泛，例如牛、羊、野猪、狐狸、浣熊、犬类、家兔、啮齿动物等，并且有报道发现人感染PRV的病例，PRV具有跨物种传播并感染人类的风险，我国已将伪狂犬病列为二类动物疫病，因此PRV致病机制还有待进一步深入研究。在伪狂犬病毒研究过程中发现UL31蛋白与UL34蛋白互作形成复合物定位于细胞核核膜，对PRV完成复制后出核起重要的作用；但目前为止U31蛋白在其中的作用机制尚未完全明确，因此展开了UL31蛋白单克隆抗体的研究，为UL31蛋白的研究奠定基础。 为了制备PRVUL31蛋白的单克隆抗体，本研究首先利用原核表达系统制备了 His-UL31重组蛋白，将纯化的His-UL31重组蛋白进行Westernblot鉴定，His-UL31重组蛋白均能与His单克隆抗体特异性结合。用His-UL31蛋白作为包被抗原，包被浓度为8μg/mL，PRV感染的猪血清稀释度达到1:25600仍可检测，建立了可特异性检测UL31抗体的间接ELISA方法。将His-UL31作为抗原来免疫12周龄雌性BALB/c小鼠，经3次免疫后取小鼠脾脏分离脾细胞并与SP2/0细胞进行融合。经4次间接ELISA方法筛选后，获得1株能稳定分泌抗UL31蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为UL315-11。对SP2/0细胞的染色体数目和UL315-11单克隆细胞进行计数，SP2/0细胞的染色体数目平均约为65条，UL315-11单克隆细胞染色体数目平均约为110条，是两亲本染色体数目之和。取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定，确定该抗体亚型为IgM。将单克隆细胞以每只小鼠5×106个的数量进行腹腔注射，最终获得大批量带有UL315-11抗体的腹水，利用辛酸-低温乙醇沉淀法获得纯化腹水，得到MAb5-11，最后通过间接ELISA方法检测单克隆抗体效价为1:5120。通过间接免疫荧光试验、蛋白印迹分析和免疫组化试验验证MAb5-11具有良好的特异性和反应原性。 本研究成功制备了PRVUL31的单克隆抗体，为进一步研究UL31蛋白的功能与结构奠定了基础。 收起